主题：动物布鲁氏菌病流行特点及防控研究进展

　布鲁氏菌病(简称“布病”)是人和动物、羊、猪等动物共患的传染病，也是国家法定检疫-扑杀被感染家畜的三大疫病(口蹄疫、布病和结核病)之一。人群发病主要是由于接触污染的环境、患病动物及其产品引起，主要表现为持续性感染状态，病人长期卧床、中壮年人群完全丧失劳动能力、妇女流产、男性睾丸炎甚至失去生育能力，伴发关节炎、脑膜炎、心内膜炎等，目前治疗极其困难;动物感染后公畜引起睾丸炎和附睾炎，母畜多数发生流产、早产、死胎等，是造成畜牧业重大损失的主要原因之一。由于严重危害和流行，致使肉、奶等产品存在严重的安全隐患，极大地影响牛羊猪等动物产品的对外贸易，并严重威胁人类的健康，因此国际上将该病列为B类生物恐怖战剂和农业生物恐怖战剂。

　　一、动物布病防控对策研究进展

　　(一)我国动物布病防控现状

　　近年来布病新患人数上升如此之快，动物疫区扩散之广，已经严重的危害人民健康和影响畜牧业发展，需要行政部门立即采取强有力措施，减少动物布病疫情给我国人民健康、社会稳定和畜牧业发展带来的重大损失和影响。考虑到动物患病率高、养殖基数大等现状，我国现阶段只能采取疫苗接种为主和检疫-扑杀为辅的防控策略。在实际生产中，我国动物接种的布病疫苗主要是牛型19号苗(S19)、猪2号苗(S2)和羊5号苗(M5)，这些疫苗为我国在“八五”和“九五”期间有效控制布病提供了重要保障，但同时也存在关键技术缺陷影响其广泛使用。首先是毒力较强、安全性较差，疫苗活菌在动物体内残存时间较长，接种S19和M5疫苗的怀孕动物可能流产、乳用动物排菌期长、公畜生殖系统受损害的风险较高，食品公共安全隐患较大;其次是缺乏鉴别诊断标记，疫苗接种动物与自然患病动物无法甄别，法定检疫措施严重受阻。这种疫苗接种动物与自然患病动物无法鉴别的技术和产品，不可避免地会使我国布病防控体系陷入有法不能依、有苗不能防的尴尬境地。此外，根据国家动物布病防疫技术规范，这些疫苗只能用于疫区动物免疫，且禁止接种怀孕动物、泌乳动物和种公畜。这样势必造成群体中免疫动物、易感动物和自然感染动物长期共存，患病动物无法识别，疫情仍然可能扩散的混乱状态，使布病控制困难重重。

　　(二)国外布病防控经验

　　根据全球布病防控方案实际执行状况和成功经验，我们将全球不同国家分成不同类型。

　　1.具有成功净化甚至根除布病经验的加拿大、新西兰和澳大利亚等国家，地广人稀、经济发达、畜牧业经济占国民经济中重要地位，但养殖业分散，政府对布病控制重视，通过检疫-扑杀-补偿等相关防控方案先后净化或根除了布病。

　　2.近年来被欧盟确认为无布病国家，如瑞典、丹麦、芬兰、德国、奥地利、荷兰、比利时、卢森堡、挪威等，属于资源密集型，经济发达、以人为本，通过检疫-扑杀-补偿等防控方案根除了布病。

　　3.亚洲的日本、新加坡等经济发达国家很早就通过上述措施净化了布病。

　　4.经济发达、科技水平高的美国，经过近百年的努力刚刚净化畜群，即将根除布病。

　　5.布病在发展中国家流行严重，但国家经济欠发达、检疫-扑杀-补偿等防控方案难以实施，因此只能采取疫苗免疫接种和适时的检疫-扑杀-补偿措施相结合的防控策略，但最终需要采取净化根除措施。

　　另外，根据美国等疫病根除经验，动物布病根除需要选择适当的时机，如国家大面积干旱时采取牛群检疫减群计划、市场萧条时采取牛群检疫选种减群计划等，错过良好的机会将会使布病净化根除方案延迟几年甚至更长时期。同时，根据上述发达国家布病控制的经验，布病防控需要长远规划和短期计划相结合，长远规划短则十几年，长则几十年才能将其净化或根除，短期计划一般为3～5年，同时还应按照需求及时调整国家或局部地区的防控方案。

　　(三)我国布病防控研究对策

　　根据当前我国布病流行和防控的实际状况，若想迅速缓解急剧上升的人群布病疫情，需要尽快做好以下几方面工作。

　　1.加强布病防控基本知识的宣传和技术推广，尤其是针对高危人群的防治技术知识的普及宣传，使患病人群能得到有效的治疗，未患病人群能防患于未然。
　　2.增加动物性食品中布病病原体的基本检测项目，使患病动物及其产品在市场中逐渐消失，促进患病动物的淘汰处理。

　　3.启动重点疫区动物普遍检疫，在淘汰阳性动物的基础上进行全群免疫接种，阻止疫情在动物群中继续扩散和蔓延。

　　4.加快建立或优化布病简便快速的检疫诊断方法，使基层人员能够及时快速地识别转运中的阳性动物，限制其远距离移动并立法实施就地处理措施。

　　5.加速布鲁氏菌标记疫苗的研究开发，使疫苗免疫动物在获得免疫保护作用的同时又能与感染患病动物进行区别，有利于临床患病动物的检疫淘汰，保护人们的健康和安全。

　　6.国家或地方制订切实可行的动物布病防控的长远规划和短期计划，并在实践中不断总结完善，使布病防控纳入政府工作计划之中。

　　(四)动物布病新型防控技术研究策略

　　为了获得毒力低、安全性高、具有诊断标记的疫苗，人们借助于现代生物学技术和分子细菌学技术，深入研究布鲁氏菌分子致病机理，鉴定毒力因子相关基因，统一毒力和安全性评价标准，并对其造成的免疫逃逸机制也有了初步认识。在此基础上，许多国际研究机构正利用基因缺失技术分别从下述层次研发布鲁氏菌新型安全标记疫苗。

　　1.通过对布鲁氏菌标准菌株的突变和表型鉴定，筛选布鲁氏菌粗糙型疫苗候选株。

　　2.通过布鲁氏菌优势蛋白抗原基因和毒力相关基因缺失，研究开发新型安全标记疫苗。

　　3.通过优势蛋白抗原基因缺失，改造现有疫苗菌株使其成为标记疫。

　　因此，在布病防控技术研究方面，无论在宏观控制方案及其实践、政策和行政措施等层面，还是在防控关键技术的研究层面，考虑到布病的危害性以及防控计划的长期性和复杂性，国际和国内研究机构始终都在进行不懈的努力和探索，借助于相应的研究结果和实践经验，我们相信国内布病疫情控制以及最终净化根除就在不久的将来。

　　二、布鲁氏菌分子致病机制及国际研究现状

　　布鲁氏菌是细胞内寄生菌之一，人们对布鲁氏菌致病机制的认识还很少。到目前为止人们尚未在布鲁氏菌中鉴定出常规病原菌具备的致病因子，如荚膜、菌毛、外毒素、胞外酶或蛋白、溶细胞素、抗原变异、抵抗型、质粒和融源性噬菌体，光滑型菌株虽然具有非典型性内毒素，毒性低于肠杆菌科病原菌的经典型内毒素几百倍，且菌体诱导机体先天性免疫反应的能力很弱，显示布鲁氏菌与其它病原菌相比的致病机制更为独特和隐藏。人和动物一旦通过接触感染动物及其产品获得感染，则布鲁氏菌借助于目前尚未完全明确的病原体-宿主细胞间分子相互作用机制侵入专业性和非专业性吞噬细胞，形成胞内吞噬小体(BCV)，从而类似于某种共生方式的生活。在宿主细胞内，布鲁氏菌因受到胞内环境和营养物质限制，菌体被诱导表达的未知分子与细胞内目前尚未查明的分子相互作用，致使BCV内部和膜表面的分子种类及状态随感染时间推移而出现规律性变化，推动BCV逃避与溶酶体结合而最后进入内质网，并在此处形成复制小体而能够长期寄居体内。在上述布鲁氏菌细胞内转运过程中，一方面宿主免疫系统难以识别胞内寄生的布鲁氏菌出现免疫逃逸现象;另一方面随着进入复制小体并进行增殖，布鲁氏菌的某些成分又能与宿主细胞相互作用影响相关杀菌物质合成或信号传导路径的启动，并诱导超强变态反应而最终导致疾病的发生。到目前为止，尽管人们已经鉴定分离了布鲁氏菌毒力相关因子(以体内细菌存活能力和时间为标准)，如菌体脂多糖(LPS)、IV型分泌系统(virB)、菌毛、环状葡聚糖、胞壁质、特定营养物质、抗酸性、抗氧化性以及某些二元调控元件和转录调控因子等，然而要完全解读布鲁氏菌分子致病机制尚有一段路程。近期本研究室通过布鲁氏菌基因组转座子插入突变文库筛选、蛋白质组学、酵母双杂交和免疫共沉淀等方法发现了若干个基因或其编码产物能与宿主细胞相关蛋白紧密结合，进一步分析鉴定其功能和特性可能在解读宿主体内布鲁氏菌感染扩散和维持等免疫逃逸的分子机制，以及布鲁氏菌致炎症、变态反应等分子机制。实际上，针对布鲁氏菌分子致病机制的相关研究文献每年大约200篇，内容涉及毒力相关基因及致病机制、毒力相关蛋白及其功能、免疫及免疫逃逸机制、感染扩散及维持机制，限于篇幅不再赘述。但截止到目前为止，所有研究都是从某一角度解释布鲁氏菌感染、致病作用和免疫及其逃逸机制，因布鲁氏菌在整个机体感染增殖过程中需要多种毒力因子的协同作用，所以布鲁氏菌分子致病机理的研究目前只是冰山一角，布病防控根除技术研究任重道远。对上述布鲁氏菌分子致病机制、毒力相关基因表达调控原理及其干预机制的深入研究正是解决布鲁氏菌病防控实践中目前存在的理论性科学难题的迫切需要，其重要意义主要在于设计、研发布鲁氏菌病治疗用新型药物以及安全、有效、无副作用的新型疫苗。
　

　　三、我国布病新型防控体系研究现状

　　回顾过去，我国布病防控研究战线的老一代科学工作者为国家布病控制做出了不朽的功绩，他们在新型菌种发现、流行传播媒介、诊断技术及试剂研发，尤其是布鲁氏菌弱毒疫苗研发方面，始终处于国际前沿。这些老一代科学家，研究开发的、具有我国自主知识产权的猪布鲁氏菌二号苗(S2)和羊布鲁氏菌五号苗(M5)至今在国内外还在使用，对我国甚至全球布病防控工作贡献巨大。

　　近十几年来，由于研究条件限制、布病疫情缓解和研究技术人员匮乏等因素存在，我国布病基础研究和防控研究处于低迷状态，许多原有的研究机构因缺少经费和人员短缺纷纷下马，保留下来的研究机构也因上述原因只能维持。因国家在布病防控及其研究方面投入不足、畜牧业快速发展、牲畜流动加快和全球布病再肆虐等因素，致使我国动物和人群布病严重流行。面对国家布病控制的技术瓶颈和动物性食品安全隐患问题，许多研究机构如中国兽药监察所、中国传染病预防控制中心、军事医学科学院、国家动物卫生与流行病学研究中心、中国农业大学、石河子大学、新疆畜牧科学院等动物布病防控及研究单位先后开展相关的防控技术研究，分别在菌株分离鉴定、流行病学调查、新型诊断方法和诊断试剂研究、常规疫苗使用优化、新型疫苗研发以及病原菌分子致病机理等方面做出了许多具有标志性的工作，本文主要介绍中国农业大学动物布病防控研究室的相关研究工作进展。

　　目前研究内容集中在布鲁氏菌分子致病机理和弱毒疫苗及诊断试剂的研究开发。在基础研究方面，为筛选不同种布鲁氏菌毒力因子基因，研究室通过转座子突变技术构建布鲁氏菌突变株文库4万余株，目前从文库中筛选弱毒菌株423个、粗糙型菌株677个，并经反向PCR方法鉴定该菌新型毒力相关基因56个、致粗糙型突变基因43个。为了确定毒力基因的作用机制、生物学功能和免疫学特性，构建38个毒力相关基因缺失突变株和24个粗糙表型相关基因缺失突变株及其互补菌株，对这些菌株的研究发现otpR操纵子主要功能是负责布鲁氏菌对外界环境的感受，相关基因缺失后布鲁氏菌在体内外被迅速清除，因该操纵子在哺乳动物体内不存在，有望作为药物作用靶点;另外更重要的发现是七个基因如布鲁氏菌耐酸性基因、休克蛋白基因、转录调控因子基因等缺失突变株经小鼠体内毒力和免疫保护效力试验证明与现有疫苗菌株相似或保护效果更佳，系统评价后有望成为新一代疫苗候选菌株;11种不同的致粗糙表型基因缺失菌株在小鼠体内毒力明显降低但程度不同，免疫保护试验为菌株筛选提供了选择指标，有望成为又一类带有免疫学标记的、能够区别疫苗免疫动物和临床感染动物的疫苗候选菌株。

　　在应用研究开发方面，为了获得布鲁氏菌的优势免疫原，我们克隆表达外膜蛋白96种、分泌性蛋白36种，筛选出变态反应性蛋白9个，这为进一步改造疫苗菌株、降低其变态反应性奠定基础，而布鲁氏菌优势蛋白免疫原筛选和鉴定正在进行中。为了研发布鲁氏菌基因缺失标记疫苗，我们对构建的60余株布鲁氏菌疫苗候选株，通过小鼠评价鉴定了布鲁氏菌标记疫苗候选株12个，已经申报国家发明专利6项，正在组织申报3项;申报转基因微生物生物安评价中间试验5项;所有候选菌株在靶动物和非靶动物相关评价正在进行中。

　　四、总结

　　1.布病是一种危害性极大的人畜共患病，在国际上被列为二类生物恐怖战剂，其发病机理复杂、群体感染后难以净化根除，对布鲁氏菌的基础研究和应用研究都十分必要，但研究过程中该菌是历史上感染科研人员频率最高的人畜共患病原体之一。因此，发达国家非常重视对该项研究的基础设施投资和建设，并实施强有力的生物安全管理制度和措施。相信我国政府也即将能够制订相关政策，鼓励科研人员为布病防控研究献身。

　　2.布病是一种可怕的疾病，同时也是一种可以净化根除的疾病，发达国家经验已经证明了这个问题。希望我国科技工作者或布病防控专员认真总结发达国家布病净化根除的经验，在我们自主防控技术研究开发的同时制订我国动物布病净化根除的长远规划和近期计划，推进布病防控工作的进行。

　　3.虽然布病是一种可以净化根除的疾病，但许多发达国家通过动物检疫-扑杀-补偿等综合技术措施历经十几年、几十年甚至更长时间才完成，而有些国家虽然采取相同措施，经过相同时间，但目前仍然未能根除。因此，我们需要坚定信心、树立长久观念，同时更需要新技术、新方法推动布病防控工作的进展。