为了提高豆粕饲料的品质，采用3种益生菌协同中性蛋白酶固态发酵豆粕，并对其发酵工艺条件进行优化。结果显示，枯草芽袍杆菌、嗜酸乳杆菌和产朊假丝酵母的最佳接种种龄为34 h，料水比为1：0.7，三种益生菌的添加比例为5：2：2加入0.1%中性蛋白酶与益生菌协同发酵，粗蛋白、酸溶蛋白和肽含量分别增加了20.25%、 26%和23.69%；发酵后的豆粕中抗原蛋白大幅度减少，游离氨基酸含量提高了13倍，豆粕的质量得到明显改善。

豆粕是大豆榨油后获得的副产品，其中不仅含有丰富的粗蛋白质，而且氨基酸组成多样，符合畜禽对氨基酸的需求，因此，豆粕被大量用于饲用蛋白原料。但是大豆中存在多种抗营养因子，会影响机体对营养的吸收，直接饲喂导致蛋白质生物转化率较低，这些抗营养因子限制豆粕在动物饲料中的应用；另外，豆粕中的过敏原蛋白也限制了豆粕在动物饲料中的应用。因此，需要将豆粕中大分子蛋白转变成肽类物质和氨基酸等小分子物质，进而提高饲料蛋白的利用率。

目前，被广泛采用处理豆粕的方法有酶解法和微生物发酵法。微生物发酵以豆粕为主要原料，使用细菌和真菌进行发酵，并经干燥制成的蛋白质饲料。用于发酵的菌种主要有细菌和真菌，细菌主要是乳酸菌类和芽孢杆菌类，真菌主要是酵母类和霉菌类。豆粕经发酵后，豆粕中的抗营养因子被大幅度减少，提高了动物消化吸收水平，并减少豆粕中其他营养成分的流失；而且微生物发酵产生的益生菌对动物肠道健康改善、降低抗生素使用等方面均有显著效果。不同微生物对豆粕蛋白质有不同的水解能力，且单菌发酵能力普遍较低，多菌种固态发酵是一种有效提高豆粕蛋白质水解度的方式。酶解法利用蛋白酶将蛋白分解为多肽，产品具有肽类含量高、免疫活性强等特点，但易产生苦味物质，影响适口性。菌酶协同发酵即采用蛋白酶对豆粕进行处理，然后加入微生物进行发酵，避免单独使用微生物发酵产酶不足的缺点，在发酵过程酵母菌和乳酸菌会产生多种香味物质和有机酸，不仅调节产品的苦味，改善饲料适口性，同时发酵后的豆粕具有抑菌能力，从而延长产品的保质期。

本研究采取菌酶协同发酵法制备豆粕饲料，选用了枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母和嗜酸乳杆菌作为发酵菌种，同时选用了中性蛋白酶对豆粕进行酶解，以发酵豆粕中肽和酸溶蛋白含量的变化为指标，优化了菌酶协同发酵豆粕的工艺。

1、材料与方法

1.1主要试剂和原料

豆粕、麦麸、玉米粉购自农贸市场，粉碎后过40目筛；中性蛋白酶≥200U/mg、胰蛋白胨、蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、牛肉膏、10% SDS、30% Acr-Bis、TEMED。

1.2菌种

枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌均为本实验室保藏菌种。

1.3培养基

LB培养基：胰蛋白胨10 g.氯化钠10 g、酵母粉5 g、蒸馏水1 L、YPD培养基：蛋白胨20g、酵母粉10 g、葡萄糖20g、蒸馏水1L。MRS培养基、蛋白胨l0g、牛肉膏8g、酵母粉4g、葡萄糖20g、柠檬酸三铵2g、CH3COONa5g、K2HP042g、MgS040.5g、MnSO40.2g、吐温801mL、蒸馏水1L。

1.4仪器

K1305A型自动定氮仪；UV-2100紫外分光光度计；TG16-W微量台式高速离心机；A300氨基酸自动分析仪。

1.5实验方法

1.5.1种子的制备

将枯草芽孢杆菌接种于YPD液体培养基中，置于150r/min摇床，30℃培养34 h；嗜酸乳杆菌接种于MRS液体培养基，置于37℃恒温培养箱培养34 h；产朊假丝酵母接种于YPD液体培养基，置于200 r/min摇床，28℃培养34 h。

1.5.2固态发酵豆粕

将豆粕、麦麸、玉米粉按90:5:5的比例分装于500 mL烧杯中，115℃灭菌30 min，冷却后，按5%接种量将种子液接入，加适量无菌水和糖蜜并搅拌均匀后，于37℃静置培养发酵7天，每隔24 h取一次样，样品60℃烘干、粉碎后－20℃保存。

1.5.3菌体生物量和pH测定

取不同发酵时间的样品1.0g，加50 mL蒸馏水，置于180r/min摇床中震荡20 min，过滤，取上清液用pH计进行测定。

1.5.4发酵豆粕指标测定

粗蛋白和酸溶蛋白含量测定采用凯氏定氮法，分别参照GB/T 6432-2018饲料中粗蛋白的测定方法和GB/T 22492-2008大豆肽的测定方法；总游离氨基酸含量的测定采用茚三酮显色法；多肽含量=酸溶蛋白含量－总游离氨基酸含量。

1.5.5感官评价

参照感官分析标准GB21172-2007和农业行业标准NYT 2218-2012，将适量样品倒入干净的平皿中，通过眼观、鼻嗅、手捻等方法，分别评定样品的颜色、气味和质地。具体标准见表1。

1.5.6游离氨基酸分析

样品处理步骤参考NY/T1975-2010，采用氨基酸自动分析仪，根据全自动氨基酸分析仪A300操作步骤进行。

2.2最适料水比的确定

基质含水量影响培养系统中的氧气供应、气体流动等，是关系到发酵成败的制约因素。根据豆粕发酵的感官评价表，不同料水比下的发酵情况得分见表2，结果显示料水比为1:0.7和1:0.8发酵效果无明显差异。当培养基中的水分过低会导致氧气不足，营养也不能很好地溶于水中，导致其利用率降低；而水分太多会导致基质多孔性降低，不利于物料内热量的散发和氧气的传递，影响菌的生长和繁殖，且含水量过高也会增加后期的干燥成本。因此确定枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌发酵的最适料水比为1:0.7。

2.3优势菌种的确定

测定料水比为1:0.7、接种量为5%、发酵时间为72h的枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌的粗蛋白含量，其结果如图2所示，枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母和嗜酸乳杆菌经过72h发酵后粗蛋白含量分别增加了12.2%, 6.6%和3.2%，确定枯草芽孢杆菌为优势菌株。枯草芽孢杆菌在发酵中产生中性蛋白酶和碱性蛋白酶且酶活力较为强盛，发酵豆粕由弱酸性转变为碱性；酵母菌在整个发酵过程中pH值变化范围较小呈偏弱酸性；乳酸菌在发酵过程中可产生大量有机酸如乳酸、乙酸和丙酸等，且时间越长作用越明显，这导致其pH值下降，但乳酸菌主要是利用碳水化合物通过生成的淀粉酶、纤维素酶等作用产酸及其他风味物质，而分泌的蛋白酶系比较少。

2.4混菌比例的确定

分别采用枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母和嗜酸乳杆菌之间比例为5:2:2、5:3:2、5:2:3，连续发酵7天，每隔24 h取一次样，测定样品中的粗蛋白、酸溶蛋白及肽含量的变化。由图3可知，发酵过程中粗蛋白含量都是呈先上升后下降趋势，在120 h达到最大值，比发酵前分别增加了19%、14.1%和13.1%。图4和图5显示酸溶蛋白和肽含量在5:2:2最高，比发酵前分别增加了17.47%和15.86%。综合考虑，三菌株间比例为5:2:2最好。

2.5菌酶协同发酵对豆粕品质的影响

在枯草芽孢杆菌：产朊假丝酵母：嗜酸乳杆菌=5:2:2的基础上添加0.1%中性蛋白酶，探讨菌酶联合对豆粕发酵品质的影响。由图6可知，发酵后粗蛋白、酸溶蛋白和肽含量分别增加了20.25 % , 26%和23.69%。菌酶联合发酵与混菌发酵相比，粗蛋白、酸溶蛋白、肽含量分别提高了1.25%、8.53%和7.83%，菌酶联合发酵后效果明显。

2.6蛋白降解情况分析

因为豆粕中含有多种抗营养因子，导致动物消化不良和肠道微生物不平衡，其中抗原蛋白含量较多，豆粕中抗原蛋白主要由β－球蛋白（(7s）和大豆球蛋白（lls）组成，7S蛋白是由三个亚基a（约67 kD)、a '（约71kD)、β（约50 kD）组成，11S蛋白是由酸性亚基（约40kDa）和碱性亚基（约20 kDa）组成。从图7可以看出，该豆粕中存在7S和11S蛋白，豆粕经过混菌发酵和菌酶协同发酵后，分子量约为97.2kD的蛋白含量提高，但是7S和11S在两种发酵条件下都得到大幅度减少，其中混菌+中性蛋白酶的发酵效果较好。

2.7氨基酸含量变化分析

蛋白质中必需氨基酸含量的高低是衡量蛋白质品质好坏的重要指标之一。取发酵后的豆粕样品为实验组，发酵前的样品为对照组，按照NY/T 1975-2010样品处理对豆粕进行前处理，然后通过氨基酸自动分析仪对样品中的氨基酸进行测定，结果如表3所示。发酵前检测出11种氨基酸，含量为1.522 mg/100 mg，发酵后检测出16种氨基酸，为21.886 mg/100 mg，游离氨基酸含量提高了13倍。        

3、讨论

本试验利用枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌固态发酵豆粕，并结合中性蛋白酶处理，对豆粕的发酵过程进行处理，优化了发酵工艺条件。菌酶协同发酵处理后，可有效提高豆粕粗蛋白含量、肽含量、酸溶蛋白和游离氨基酸含量，与未发酵豆粕相比，粗蛋白、酸溶蛋白和肽含量分别增加了20.25 %,26%和23.69%；而与混菌发酵相比，菌酶协同处理后粗蛋白、酸溶蛋白和肽含量分别提高了1.25%,8.53%和7.83%，菌酶联合发酵豆粕效果显著。

通过菌酶协同作用，使豆粕中大分子蛋白得到一定程度的降解，提高了豆粕中的小肽含量，小肽被分解为氨基酸、多肽和氨等小分子物质，并去除了多种抗营养因子，有利于畜禽对豆粕的消化和吸收；在发酵过程中，由于酵母菌和乳酸菌的作用，使豆粕具有香味和一定的酸度，避免了添加酶带来的不适口感，改善了豆粕的适口性，具有刺激食欲和增强牲畜免疫能力的作用。在微生物发酵过程中，采用的乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌是益生菌，这些益生菌可以改善畜禽肠道的微生态环境，抑制牲畜肠道有害菌群的繁殖，维持肠道益生菌群平衡，降低牲畜腹泻率。

通过蛋白酶的分解作用也能够提高豆粕蛋白产生小肽物质，其中有些小肽具有较好的免疫活性，常用的有酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶等，其中中性蛋白酶价格便宜，且具有一定的脱苦作用，在饲料工业常作为酶解豆粕的酶制剂。目前，菌酶协同处理表现出了极大的优势，也成为了关注热点。张煌等（2018）通过菌酶协同发酵，能够显著改善豆粕的品质。周爽等（2016）利用枯草芽孢杆菌和中性蛋白酶协同发酵豆粕，发酵后的豆粕其小肽含量得到大幅度提高。目前采用单菌种协同酶处理的发酵研究较多，但混菌发酵可以弥补单菌发酵的不足，能够更好地提高豆粕的营养和降低生长抑制因子。本研究主要集中在混菌发酵和中性蛋白酶联合处理工艺的研究，后续可以采用其他蛋白酶联合处理，并筛选出最佳的发酵温度、PH、接种量等工艺参数，从而获得更好的豆粕发酵工艺。

实战操作技术——棉菜籽饼脱毒变身优质饲料替代豆粕操作新技术

当前豆粕价格很高有些地方货源紧缺，而棉菜籽饼（棉籽粕、菜籽粕）价格相对便宜，棉菜籽饼是棉子、油菜籽榨油后剩下的饼状残渣，蛋白质含量较高，含有各种氨基酸成分。但由于棉菜籽饼中含有植酸、芥子碱等物质，这些物质含有一定的毒性，还会影响动物的消化吸收，不能大量使用，因此不建议直接饲喂给动物！

现在通过微生物饲料发酵剂的除毒脱毒技术，可以成功将菜籽饼变为优质添加饲料，直接按照1公斤发酵的棉菜籽饼（发酵前的重量）代替约0.85公斤豆粕进行使用。饲料发酵剂中的有益微生物，在发酵过程中分泌的代谢产物，可将棉菜籽饼中的毒性物质等有效分解。

豆粕、菜粕、棉粕成分对比

1.豆粕是一种高蛋白原料，无需脱毒即可用作饲料。其中蛋白质含量为40%-48%，赖氨酸含量为2.5%-3.0%，色氨酸含量为0.6%-0.7%，蛋氨酸含量为0.5%-0.7%。2020年11月12日报价每吨在3500元左右。

2.菜粕的粗蛋白含量在34%-38%之间，特点是蛋氨酸含量高（仅次于芝麻饼、粕），赖氨酸含量亦高。而精氨酸含量低，是饼、粕饲料中含量最低的。菜籽粕的有效能值偏低（淀粉含量低、菜籽壳难以消化利用）。矿物质中，钙和磷的含量均高，硒和锰的含量亦高。特别是硒的含量是常用植物饲料中最高的。2020年11月12日报价每吨在2900元左右。

3.棉粕蛋白质含量一般为44.32%，仅次于豆粕的蛋白质含量48%，而高于菜籽粕的蛋白质含量36.04%。精氨酸含量高达3.6%-3.8%，而赖氨酸含量仅有1.3%-l.5%，只有豆粕的一半。2020年11月12日报价每吨在3000元左右。

是否需要脱毒处理

1.豆粕无需经过脱毒即可用作饲料。而且豆粕中富含蛋白质和多种氨基酸，在不需要额外加入动物性蛋白的情况下，仅豆粕中含有的蛋白质和氨基酸足以平衡家禽和猪的食谱，促进它们的营养吸收。只有当其他粕类单位蛋白成本远低于豆粕时，豆粕才有可能被替代。

2.菜粕菜籽中含有硫葡萄糖苷、芥酸、单宁、皂角苷等不良成分，其中主要是硫葡萄糖苷。硫葡萄糖苷本身无毒，但在一定温度和水分条件下，经过菜籽本身含有的芥子酶的酶解作用而产生异硫氰酸酯、唑烷硫酮和腈类等有害物质。这些物质可引起甲状腺肿大，从而造成动物生长速度下降，繁殖力减退。单宁则妨碍蛋白质的消化，降低适口性。而芥酸阻挠脂肪代谢，造成心脏脂肪蓄积及生长受到抑制。。使用前需进行一定的脱毒处理，并且使用时要加以限制，具体喂量应根据菜粕中有害成分含量而定。经过脱毒处理的菜籽粕喂量可以加大，而“双低”油菜籽生产的菜粕喂量要受限制。同时，应结合菜粕的氨基酸组成特点，适当搭配其它饼粕。

3.棉籽中含有对动物有害的棉酚及环丙烯脂肪酸，尤其是棉酚的危害很大。在制油过程中，由于蒸炒，压榨等热作用，大部分棉酚与蛋白质、氨基酸结合而变成结合棉酚，结合棉酚在动物消化道内不被动物吸收，故毒性很小。另一部分棉酚则以游离形式存在于饼、粕及油品中，这部分游离棉酚对动物毒性较大，尤其单胃动物过量摄取或摄取时间较长，可导致生长迟缓、繁殖性能及生产性能下降，甚至导致死亡。幼小动物对棉酚的耐受能力更低。由于棉籽饼、粕中游离棉酚对动物有害，因此，在使用棉饼、粕时，要根据饲喂对象及饼粕中游离棉酚的含量加以限量。反刍家畜在有优质粗料及多汁青料的情况下，棉籽饼、粕的用量不受限制，不会造成中毒。对单胃动物要限制喂量，最好使用经过脱毒处理的棉籽饼粕。同时，使用棉籽饼、粕配制饲粮要注意氨基酸平衡，尤其是棉籽饼、粕的赖氨酸含量低，且利用率差，应注意添加赖氨酸。

发酵操作技术

发酵棉菜籽饼其实也是一个脱毒技术，具体操作如下：

1.仔细检查棉菜籽饼，剔除棉菜籽饼中严重变质发霉的部分，轻度发霉的原料可以忽略，因为微生物发酵能够脱霉。

2.将棉菜籽饼粉碎并添加适量的玉米粉淀粉类的能量饲料等，调节饲料营养比例。

3.每吨棉菜籽饼加入2公斤食盐、玉米粉（其它淀粉、面粉次粉等也可以，或者粉碎的生红薯300公斤也可以）100公斤、“99多功能饲料发酵剂”1包（500g/包，市场售价约25元，以高浓度乳酸菌、酵母菌、复合酶制剂的专业发酵剂）。

4.在混合物料中添加适量水分，使混合物料含水量保持在55%左右，以“手抓一把并紧握，无水滴落，松手后轻触即散”为宜，一般上述配方中需要加入清水约500-600公斤。

5.发酵方式根据实际环境条件各异，在桶、缸、塑料袋等容器中发酵均可。

6.发酵时要尽可能排尽空气进行密封发酵。如果使用的发酵容器有密封不严实的隐患，要在一开始就在其外层包裹一层塑料袋并扎紧。发酵过程中不能启封。

7.发酵时间受环境温度影响，通常夏季发酵2-3天，冬季发酵5-7天即可完成。发酵完成后，有较为强烈的酸香味，ph值在3-4。

规模运用混合发酵现场

塑料缸、饲料袋（有内膜）均可做发酵饲料

采用池子发酵

发酵完成的棉菜粕饲喂动物技术

需要注意的是，发酵后的饲料酸度较低，不可以取代禽畜全部日粮。其他类发酵饲料同理。饲喂时根据不同情况，将发酵饲料按照一定比例添加到日粮中，发酵完成的棉菜粕为湿料，具体使用量每大概1.5-2公斤发酵棉菜粕（湿料）代替动物日粮配方中1公斤豆粕的使用量进行代替使用，与其它饲料混合后直接饲喂，由于棉菜籽粕蛋白较高，最高使用量不要超过禽畜日粮饲喂量的40%（湿料重量）。如果发现发酵饲料过酸适口性变差，可在饲喂前在阳光下晒1-2小时，或添加适量的碳酸氢钠（小苏打）即可改善。

发酵过程中与发酵后使用过程中，发酵的容器要一直保持密封状态，可以长时间保存（一年左右）。

当前养殖业成本高居不下，而饲料成本是其中最高的，利用廉价原料发酵饲料（包括一些轻度发霉的粕类低价收回）是极佳解决办法。通过微生物饲料发酵剂的发酵作用，可以将轻度霉变饲料变成优质饲料，将不易消化的物质分解为可被畜禽吸收的小分子糖类、氨基酸等。同时发酵饲料中富含有益微生物、酶制剂、酸化剂等，可调节畜禽肠胃微生态环境并进一步提高饲料利用率。发酵饲料气味清香，提高了饲料的适口性，加上发酵饲料中有大约4℃的酒度，能够促进动物新陈代谢促进健康抵御疾病，是当前养殖业发展中重要的一环。

本技术也可以同样发酵菜籽粕（饼）、棕榈粕等，方法同上。

【视频】部分发酵饲料养猪鸡鸭带给你无臭味健康无抗养殖效果

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