导读

    抗生素在畜牧生产中的滥用，导致抗药、耐药、残留及超级病菌的产生，已引起了世界各国的普遍关注。许多国家已经禁止抗生素作为饲料添加剂，寻找一种绿色环保型抗生素替代品———微生态制剂也就应运而生。益生菌是一种微生物补充剂，通过改善宿主肠道微生物菌群平衡，对宿主产生有益的效果。益生菌之所以对人和动物体的健康有益，与其生物学特性紧密相关，可帮助宿主提高营养物质的消化利用率。益生菌能黏附在人和动物肠道黏膜上生长繁殖，是其产生有益作用的前提之一。当益生菌在肠道内定植并大量繁殖后，可竞争性地与病原微生物争夺营养物质，并产生相应的细菌素等生物活性物质，来抑制病原微生物的生长和繁殖，从而提高机体的健康水平。譬如乳酸菌产生的乳酸等有机酸能降低肠道pH值，在动物处于应激状态时亦能维持肠道内环境的稳定，防止病原菌因势而起；还有一些益生菌能产生抗菌肽，从而抑制有害菌的生长。益生菌能刺激肠道黏膜，产生黏膜免疫应答，增强体液和细胞免疫，促进抗炎因子的产生，减少炎症反应。研究表明乳酸菌能激活巨噬细胞，增强对致病菌的杀灭作用，提高黏膜免疫相关因子的表达水平，从而提高机体免疫力。

    仔猪由于胃肠道发育不健全，同时在其生长过程还伴随着断奶、饲料变化、转舍等应激因素，将会导致仔猪肠道菌群紊乱，易引发疾病，致使仔猪成活率低。目前，益生菌广泛应用于我国养猪业生产中。研究发现，在哺乳仔猪的教槽料中添加复合益生菌，可提高仔猪日增重，降低仔猪腹泻率和死亡率，并降低仔猪生长前期粪便中大肠杆菌数量及提高乳酸菌数量，对改善肠道健康具有重要意义。另据报道，利用嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌灌服哺乳仔猪，发现益生菌能显著提高仔猪日增重、血清免疫球蛋白含量及肠道乳酸杆菌数量，降低仔猪腹泻率和粪便中大肠杆菌数量，并对小肠绒毛的发育有促进作用。由于不同的益生菌及其组合具有不同的益生功能，研究和开发新的复合益生菌对仔猪的健康生产具有重要意义。

    本研究根据益生菌对病原菌生长和繁殖的抑制作用，制成干酪乳杆菌和粪肠球菌的复合液体制剂，以哺乳仔猪为试验对象，探索益生菌对乳仔猪生长性能和健康状况的影响，为哺乳仔猪健康生长提供良好的理论和实践指导。

1.1 菌种选择

     试验选用干酪乳杆菌（Lactobacillus Casei）和粪肠球菌（Enterococcus faecalis）菌种均购自中国科学院微生物研究所，并由河南农业大学动物营养与生物技术研究室保存。根据本研究室前期的工作基础，确定干酪乳杆菌和粪肠球菌的比例为3∶1时，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长的抑制能力最强，并以此配比进行下一步的哺乳仔猪试验。

1.2 培养基及培养方法

     培养干酪乳杆菌和粪肠球菌的乳酸细菌培养基（MRS）组成：胰蛋白胨15ｇ、酵母浸粉1ｇ、葡萄糖20ｇ、吐温－80 1mL、磷酸氢二钾2ｇ、乙酸钠5ｇ、柠檬酸铵2ｇ、硫酸镁0.2ｇ、硫酸锰0.05ｇ，用蒸馏水定容至1L，在MRS液态培养基中加入1.5％琼脂可制备MRS固态培养基，2种培养基在121℃、0.15MPa高压蒸汽灭菌20min备用。干酪乳杆菌和粪肠球菌37℃静置培养24ｈ，测定培养液的活菌数，分装并于4℃保存备用，使用前调整2种菌活菌数为1×10⁹ CFU／mL。粪便中乳酸菌数量的测定采用厌氧管滚管培养法，在37℃下静置培养48ｈ。微生物数量的表示方法，以每1mL或1ｇ样品中所含的菌落数（CFU）为标准，以自然对数值（Lｇ）表示。

    培养大肠杆菌的伊红美蓝鉴别培养基（EMB，北京奥博星）组成：称取EMB 42.5ｇ，加入1L蒸馏水，在121℃、0.15MPa高压灭菌20min，制备含培养基的平皿备用。大肠杆菌37℃静置培养48ｈ，其菌落呈现亮紫色。

1.3 试验设计及动物的饲养管理

     试验选择品种相同（长白×大白×杜洛克三元杂交）、出生日期和体质量相近的仔猪15窝，每窝选择8头，共120头仔猪，分为4个处理组，每个处理组15个重复，每个重复2头仔猪（公母各半）。对照组，灌服生理盐水；试验Ⅰ组：灌服干酪乳杆菌培养液；试验Ⅱ组：灌服粪肠球菌培养液；试验Ⅲ组：灌服干酪乳杆菌和粪肠球菌混合培养液。

    试验从仔猪出生开始持续至21日龄断奶，并延续1周，试验期为28ｄ。所选仔猪均在同一猪舍内，舍内清洁干燥、通风良好，舍内温度和相对湿度分别为（25±2）℃和65％～70％。仔猪保育箱内第1周和第2周温度分别为（33±2）℃和（30±2）℃，然后维持在（25±2）℃。试验期间饲养管理和免疫程序均按规模化猪场统一要求执行。仔猪出生第1天灌服1mL益生菌制剂，以后每隔7ｄ灌服1次，每次递增1mL至21日龄，对照组灌服生理盐水。仔猪7日龄后开始添加教槽料至28日龄，期间自由采食和饮水。

1.4 生长性能的测定

    在仔猪出生后，称取每头仔猪的初始体质量；在21，28日龄时，分别称取每头仔猪的体质量，并计算仔猪的日增重。每天观察仔猪精神状态及腹泻情况（以粪样颜色及是否水样等为准），计算腹泻率及死亡率。腹泻率＝仔猪腹泻头次／试验头数／试验天数×100％；死亡率＝仔猪死亡头数／试验头数×100％。

1.5 胃肠道消化酶活性和pH值的测定

    选择对照组和复合益生菌组21日龄仔猪各3头，心脏放血处死，采集消化道各段的内容物各5ｇ，分别于4℃和－20℃保存，用于测定各肠道内容物中微生物数量和消化酶活性。蛋白酶的测定参照国家标准（1999）推荐的中性蛋白酶活的测定方法，即福林法。蛋白酶活性的定义为：在40℃条件下，每1min产生1μｇ酪氨酸定义为1个蛋白酶活力单位（U）。蛋白酶活（U／ｇ）＝测得的酪氨酸含量／反应时间×4×样品稀释倍数／样质量。淀粉酶活性采用DNS法，淀粉酶活性定义为每1min产生1ｍｇ葡萄糖所用酶量为1个酶活力单位（U）。淀粉酶活（U／ｇ）＝样品中还原糖含量×样品稀释液总体积×稀释倍数／样品质量／测定所用酶体积／5。另外，取适量胃肠道内容物于试管中，用pHＳ－2Ｃ酸度计测定样品pH值。

1.6 粪样及胃肠道微生物菌群的测定

    于21，28日龄，每组分别采集5头仔猪的无污染粪样5ｇ，于4℃保存，用于乳酸菌和大肠杆菌的活菌数测定。具体操作如下：分别准确称取0.5ｇ样品加入4.5mL生理盐水（稀释液测定大肠杆菌）或MRS溶液（稀释液测定乳酸菌），依次进行10倍梯度稀释至1×10^-6。采用稀释涂布平板法和伊红－美蓝固态培养基测定大肠杆菌活菌数；利用厌氧管和固态MRS培养基测定乳酸菌活菌数。2种菌分别在37℃培养48ｈ，然后进行计数。

1.7 血清生化指标的测定

   在仔猪21日龄断奶当天，每组选取5头仔猪进行前腔静脉采血，血液于4℃倾斜放置过夜，分离上层血清于－20℃保存备用。利用全自动血液生化分析仪进行血清各项指标的测定。

1.8 数据统计和分析

    数据分析采用SPSS软件进行方差统计分析，各处理组间平均值采用Duncan氏多重比较进行差异显著性检验，结果用（ｘ±ｓｘ）表示，以P<0.05表示差异显著。

2.1 益生菌对哺乳仔猪生产性能的影响

2.1.1 益生菌对哺乳仔猪增重的影响

    由表1可知，试验组仔猪21，28日龄平均日增重均显著高于对照组（P<0.05），其中以试验Ⅲ组最高，3个试验组之间差异不显著（P>0.05）。