制作5种不同酶解豆粕添加量的等氮等能饲料(表2)。所有原料经破碎后，过80目筛网，按照饲料配方比例称重并采用四分法逐级扩散混匀，依次加入油脂和水搓匀，经绞肉机挤压并制粒，90℃熟化20min，于阴凉通风处晾干，将成品饲料破碎成适合养殖期间各生长阶段对虾采食的饲料粒径，−20℃冰箱保存。

1.2 养殖管理

实验用凡纳滨对虾虾苗购自上海联旺水产科技有限公司(养殖水体盐度为5)，虾苗暂养于水泥池内，逐步淡化，直至水体盐度降至0。淡化期间，投喂商品虾片，虾苗暂养30d，挑选规格整齐、健康的对虾1000尾，平均分成5组，每组设4个重复，初始均重为(0.45±0.02)g，随机分配到同一水泥池(5.0m×11.0m×1.2m)中的20个网箱(1.0m×1.0m×1.2m)内，每个网箱内投放50尾幼虾。每日投喂4次，分别在5:30、10:30、16:30和22:30等4个时间点投喂，日投喂量约占虾体质量的5%~8%，并根据天气、摄食情况以及生长阶段进行调整。养殖实验持续8周，养殖期间每周换水2次，进水经200目滤水袋过滤，水体透明度维持在20~40cm。养殖期间保持连续充气，水体溶氧量控制在6mg/L以上，pH为7.8~8.5，氨氮浓度低于0.2mg/L，水温为(30±2)℃，水体盐度为0。

1.3 样品采集

生长性能测定 养殖8周，停止投喂24h后，逐个网箱称重、计数。每个网箱随机取凡纳滨对虾8尾，用1mL一次性无菌注射器于对虾围心腔处取血淋巴后置于1.5mL离心管中，放置于冰盒保存；在托盘上快速解剖对虾，取肝胰腺和肌肉于冰盒保存，并随机取3尾对虾的鳃迅速置于盛有RNA保存液(北京天根公司)的1.5mL的离心管中，血淋巴经4℃、10000r/min离心10min取上清液，所有样品于−80℃冰箱保存。各类生长指标计算方法如下：

成活率(survivalrate，SR，%)=Nt/N0×100%

饲料系数(feed conversion ratio，FCR)=Wf/(Wt-W0)

特定生长率(specific growth rate，SGR，%/d)=(lnWt/Nt-lnW0/N0)/t×100%式中，Nt为终末尾数，N0为初始尾数，Wf为每个网箱所投饲料总重(g)；Wt和W0分别为实验结束和开始时每个网箱虾总重(g)；t为实验天数(d)。

高浓度副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)人工急性感染实验实验

所用副溶血性弧菌菌株取自上海海洋大学病原库。8周实验结束后，每组随机捞取30尾对虾，分3个平行，置于15个网箱(50cm×30cm×80cm)中，每个网箱10尾。菌种需经虾体活化后于硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(TCBS)分离培养，预实验需注射活化菌液于同规格虾体中，观察96h内凡纳滨对虾的死亡情况，筛选出最适半致死浓度。根据预实验结果，每尾虾腹部注射35μL6.25×107CFU/mL经活化培养后分离的副溶血性弧菌菌液，对照组取同规格对虾注射无菌生理盐水。实验期间持续曝气，水温控制在(30±1)℃。注射菌液后连续观察网箱中各饲料组对虾的死亡情况，在24、36、48、72、84和96h时分别统计各网箱的累积死亡率。

低浓度副溶血性弧菌人工急性感染实验

8周实验结束后，每组随机捞取75尾凡纳滨对虾，分成3个平行，放置于15个(50cm×30cm×80cm)网箱中，根据预实验的结果，活菌液用4%甲醛溶液灭活1h，4℃、3000r/min离心10min，取底部离心物用生理盐水反复冲洗、离心。每尾虾腹部注射25μL1.25×106CFU/mL经灭活的副溶血性弧菌菌液，对照组取同规格的对虾注射无菌生理盐水。养殖水体温度为(30±1)℃，水体盐度为0，24h持续曝气。分别在0、6、12、18、24、30、36、42和48h从每个网箱取3尾对虾，采集鳃组织并分别存放于装有RNA保存液(北京天根公司)的离心管中，−80℃保存，用于测定鳃组织中免疫相关基因的相对表达量。

1.4 样品检测分析

饲料及凡纳滨对虾肌肉常规检测分析 饲料和肌肉中的水分含量采用105℃烘箱干燥恒重法检测(GB/T 6435—2014)；粗脂肪采用氯仿-甲醇法检测(GB/T 6433—2006)；灰分采用550℃马弗炉灼烧法检测(GB/T 6438—2007)；粗蛋白质采用凯氏定氮仪(KjeltecTM 2300，瑞典)检测(GB/T 6432—2018)。

血清及肝胰腺生化指标 对虾肝胰腺用冰浴匀浆处理，稀释成相应的组织匀浆液，匀浆液于3000r/min、4℃条件下离心10min，取上清液。肝胰腺蛋白酶活性采用Folin-酚法、脂肪酶活性采用对硝基苯酚法、淀粉酶活性采用淀粉-碘比色法(南京建成试剂盒)。离心后的血清经生理盐水稀释后，按照试剂盒说明书(南京建成生物工程研究所)测定各抗氧化指标。

低浓度副溶血性弧菌感染后凡纳滨对虾免疫相关基因表达量检测 按照Trizol试剂盒(TaKaRa)说明书从对虾鳃组织中提取总RNA。用NanoDrop2000超微量分光光度计测定其OD260nm和OD280mm比值，并用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性。将提取的总RNA用TaKaRa公司PrimeScript@RT reagent Kit with gDNA Eraser(Per-fect Real Time)试剂盒反转录为cDNA，−20℃保存。

参照凡纳滨对虾Toll受体mRNA(GenBank：DQ923424.1)、溶菌酶mRNA(GenBank：AYl70126.2)、IMDmRNA(GenBank:FJ592176.1)和β-actin基因(GenBank:AF300705)设计荧光定量引物，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表3)。

采用RT-PCR仪(Bio-rad公司)按照SYBR@PremixExTaqTM(TliRNaseHPlus)试剂盒(TaKaRa公司)说明书进行荧光定量PCR(RT-PCR)检测，RT-PCR程序为95℃、30s预变性；95℃、10s，60℃、30s，共39个循环；反应完成后温度由65℃上升到90℃，测定熔解曲线检测反应特异性。结果采用相对表达量的形式，根据2−ΔΔCt计算法进行计算。

1.5 数据处理和统计分析

实验结果用平均数±标准差(mean±SD)的方式表示，数据使用SPSS25.0分析软件中的单因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan氏多重比较法进行差异显著性分析，P<0.05则表示为差异显著。

2 结果

2.1 饲料中添加酶解豆粕对凡纳滨对虾生长性能的影响

8周养殖实验结束后，各实验组凡纳滨对虾成活率均在97%以上；各组对虾终末均重为14.65~15.38g/尾；饲料系数呈现出先下降后升高的趋势，A组最高；特定生长率呈现出先升高后下降的趋势，最低组为A组；各组间均无显著性差异(P>0.05)(表4)。

2.2 饲料中添加酶解豆粕对凡纳滨对虾肌肉常规组成的影响

凡纳滨对虾肌肉中粗蛋白质含量，A组显著低于其他各实验组(P<0.05)，E组最高；对虾肌肉中粗脂肪含量随着酶解豆粕添加量的增加，整体呈现升高的趋势，A组显著低于C组、D组和E组(P

2.3 饲料中添加酶解豆粕对凡纳滨对虾肝胰腺消化酶的影响

对虾肝胰腺中蛋白酶活性随饲料中酶解豆粕添加量的增加呈升高的趋势，D组和E组显著高于A组和B组(P<0.05)；B组、D组和E组对虾的淀粉酶活性显著高于A组(P<0.05)；对虾的脂肪酶活性随饲料中酶解豆粕添加量的增加整体呈现出升高的趋势，D组和E组显著高于A组(P<0.05)(表6)。

2.4 饲料中添加酶解豆粕对凡纳滨对虾血清溶菌酶和抗氧化能力的影响

随饲料中酶解豆粕添加量的增多，各组凡纳滨对虾血清溶菌酶活性呈先升后降的变化趋势，A组最低，D组最高且显著高于其他各组(P<0.05)；血清中T-SOD活性随饲料中酶解豆粕添加量的增多而增高，E组最高，且显著高于其他各组(P<0.05)；血清丙二醛含量随饲料中酶解豆粕添加量的增多呈现先降后升的变化趋势，A组最高，且显著高于其他各组(P<0.05)(表7)。

2.5 饲料中添加酶解豆粕对感染高剂量副溶血性弧菌的凡纳滨对虾成活率的影响

在对虾腹部注射35μL6.25×107CFU/mL经活化培养后分离的副溶血性弧菌，各组对虾96h内的累积死亡率显示，A组对虾在各个时间点的累积死亡率均高于其他各组，D组对虾在各个时间点的累积死亡率均低于其他各组，且在48和60h时显著低于A组(P<0.05)(图1)。

2.6 饲料中添加酶解豆粕对凡纳滨对虾急性感染副溶血性弧菌后免疫相关基因表达量的影响

凡纳滨对虾人工急性感染副溶血性弧菌后对虾Toll受体mRNA表达量最大峰值出现在24h、C组，A组于42h出现峰值，B组、C组和E组峰值均大于A组(P<0.05)(表8)。对虾IMD mRNA表达量最大峰值出现在42h、B组，饲料中添加酶解豆粕的各实验组峰值均大于A组，其中在18h时对IMD mRNA表达量影响最显著(P<0.05)(表9)。对虾溶菌酶mRNA表达量最大峰值出现在24h、D组，其中D组和E组峰值均大于A组，饲料中添加酶解豆粕在12h时对溶菌酶mRNA表达量影响最显著(P<0.05)(表10)。

3 讨论

3.1 饲料中添加酶解豆粕对凡纳滨对虾生长性能的影响

研究发现，相对于完整的蛋白质，动物的肠道组织细胞对肽具有更高的吸收效率。经测定，实验所用酶解豆粕中相对分子量<1000的肽含量占72.83%。通过对蛋白水解产物的研究表明，去除蛋白水解物中的小分子，会降低饲料的利用率，从而发现蛋白水解所产生的小分子复合物对于水生动物的生长至关重要。有研究表明，分子量为1000~3000的水解大豆肽能够有效促进真鲷(Pagrus major)和牙鲆(Paralichthys olivaceus)的生长。本实验结果显示，随着酶解豆粕添加量的增加，虽然对虾的终末均重和特定增长率都有一定的增长趋势，饲料系数也有一定程度的降低，但是添加5.5%以内的酶解豆粕对凡纳滨对虾生长性能的改善效果并不显著，分析原因可能与饲料中小分子肽的总含量较少有部分关系。有研究表明，饲料中大豆多肽添加量低于20%时，对牙鲆幼鱼的生长性能和饲料效率并没有产生显著的影响。不同饼粕蛋白酶解产物肽的种类和分子组成不同，对异育银鲫(Carassiusauratus gibelio)产生的营养效果也不同，饲料中小分子肽比例越大，饲养的鱼类生产性能表现效果越好。

随着酶解豆粕添加量的增加，凡纳滨对虾肌肉中粗蛋白含量相较于对照组均有显著的提高。一方面可能与饲料中普通豆粕含量的降低有部分关系，有研究表明，水生动物的总蛋白水平会随着饲料中豆粕含量的增加而降低；另一方面可能是酶解豆粕对凡纳滨对虾的蛋白质沉积具有促进作用，相较于大豆蛋白，动物体对大豆肽的吸收更加高效且迅速，减少了动物在吸收过程中的能量消耗，从而促进了动物体内蛋白质的沉积。研究发现，建鲤(Cyprinus carpio var.Jian)饲料中的鱼粉或植物蛋白被等量蛋白肽替代后，可促进鱼体粗蛋白质沉积，并降低了内脏重量，优化了建鲤形体指标。而且随着饲料中豆粕含量的增加，非淀粉多糖对水生动物的影响也会更加明显。非淀粉多糖在体外和体内均可降低脂肪酶等的活性，影响水生动物对外源脂肪的吸收转运，而此次实验中各实验组粗脂肪含量随酶解豆粕使用量的增加呈现显著上升的趋势，分析原因可能是本实验所用酶解豆粕是用蛋白酶和非淀粉多糖酶复合酶解，一定程度上降低了豆粕中所含的非淀粉多糖阻碍对虾对外源脂肪吸收转运的不利影响。各组对虾肌肉水分和灰分没有显著性差异，说明此次实验中酶解豆粕并未对肌肉中其他成分产生影响。

酶解豆粕添加量达到4.5%以上时对对虾的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均有显著提高，这也与以往的许多研究报道相吻合。豆粕过量替代鱼粉会对鲤(Cyprinus carpio)肠道产生损伤同时也会降低肝胰脏蛋白酶的活性。从尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)体内也检测到，豆粕对消化蛋白酶具有很高的抑制作用。而对虾对食物的消化吸收能力很大程度上依赖于消化酶的活性。豆粕中胰蛋白酶抑制因子是影响水生动物对大豆蛋白消化吸收的主要抗营养因子，动物体内胰蛋白酶会随着外部的胰蛋白酶抑制因子的进入反应形成难以被动物体消化吸收的复合物，从而失去应有的活性。通常大豆经酶处理后，消化率会得到相应的改善，这种酶处理方法在鱼类摄食前就可引发蛋白质降解。有研究显示，饲料中大豆水解蛋白替代15%~70%的鱼粉时，能够显著提高星斑川鲽(Platichthysstellatus)幼鱼的胰蛋白酶活性。

3.2 饲料中添加酶解豆粕对凡纳滨对虾抗胁迫机能的影响

机体抗氧化能力是评价水产动物健康状况的一个重要指标。自由基是一种具有较强氧化作用的物质，当机体应激产生过多自由基时，会氧化组织从而对机体造成损伤。因此机体需要一套健全有效的抗氧化防御体系来调节体内自由基含量，保持机体健康。

蛋白质水解产生的小分子肽，在机体内具有较强的抗氧化活性。研究显示，酶解大豆蛋白具有较高的还原能力、较高的乳化液抗氧化能力和较强的清除自由基能力，而其抑制β-胡萝卜素漂白的能力与合成抗氧化剂能力相当，分子量小于10000的酶解大豆蛋白相较于普通大豆蛋白显示出更高的抗氧化活性。有研究指出，从各种蛋白质水解产物中提取到的生物活性肽，可通过上调抗氧化酶活性，发挥出其潜在的抗氧化作用。饲料中利用大豆蛋白水解物替代鱼粉的实验表明，当替代量达到15%~100%时会显著增强星斑川鲽幼鱼的SOD活性，替代量达到30%~100%时，实验组MDA含量显著低于对照组。本实验结果显示，低鱼粉饲料中酶解豆粕含量对凡纳滨对虾血清溶菌酶、T-SOD活性和MDA含量具有显著影响。已有研究表明，利用食品级猪胰腺蛋白水解制剂(CorolasePP)酶解大豆粕，通过ABTS和ORAC方法检测大豆肽水解物的抗氧化活性，结果显示酶解大豆得到的大豆肽具有较高的抗氧化活性。在饲料中添加水解蛋白产物，会促使牙鲆体内溶菌酶和SOD活性显著增加。酶解大豆蛋白得到的大豆多肽可提高对动物机体内自由基的清除能力，在调节机体免疫功能、抗氧化和促进矿物元素吸收等方面也发挥着重要作用。相较于普通大豆蛋白，大豆肽增加了清除自由基能力，提高了机体总抗氧化活性和还原能力。

凡纳滨对虾的免疫机能主要是依靠非特异性免疫起作用，而活体攻毒是指在一定剂量致病菌的攻击下直观反映机体综合免疫机能的实验手段。通过研究副溶血性弧菌对凡纳滨对虾生理生化指标的影响表明，副溶血性弧菌的感染会破坏虾体的免疫系统，导致免疫机能损坏。有研究表明，在饲料中添加5%~15%的水解蛋白，对花鲈(Lateolabrax japonicus)的非特异性免疫反应有所改善。在低鱼粉饲料中添加蛋白水解物饲喂牙鲆幼鱼的实验中发现，饲料中添加蛋白水解产物能提高鱼体的先天免疫能力。本实验结果显示，随着感染时间的增加，饲料中添加酶解豆粕对凡纳滨对虾免疫力的改善效果明显，对照组在各时间点累积死亡率均比其他实验组同期累积死亡率高。已有研究报道，在大豆水解物中可分离鉴定出抗菌肽，其对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和副溶血性弧菌的生长有抑制作用，可提高对虾的存活率。通过同源序列比对发现，大豆肽中含有一种能够刺激巨噬细胞和多核白细胞吞噬作用的物质，通过刺激细胞吞噬作用，提高动物机体的免疫力。

营养控制是调节非特异性免疫反应并提高抗病性的有效方法。Toll受体在介导虾体启动天然免疫并释放免疫因子的机制中起着关键作用。当对虾受病原菌入侵时，Toll受体将异物入侵的信号从胞外传递到胞内，并引起胞内信号级联反应，介导细胞启动先天免疫反应。IMD通路是一个重要免疫识别信号传导通路，革兰氏阴性细菌和杆状阳性细菌能通过跨膜蛋白PGRP-LC激活IMD信号途径并诱导细胞产生免疫效应因子。溶菌酶作为机体非特异性免疫级联反应的终端效应因子，除了能溶解细菌细胞壁外，溶解细胞壁时释放的肽聚糖片段还能诱导各种抗菌蛋白包括溶菌酶的合成与分泌。对虾进行弧菌实验时，机体免疫基因表达水平均升高，Toll受体mRNA的表达水平在一定程度上可以反映对虾对入侵病原识别的灵敏性，而机体清除异物后恢复至正常状态的过程，在一定程度上反映了机体的免疫平衡性，提高机体免疫的灵敏性和平衡性是提高机体免疫力的根本途径。此次实验结果显示，对照组Toll受体mRNA表达量峰值出现时间最晚，一定程度上可以反映饲料中添加酶解豆粕有助于提高凡纳滨对虾对入侵病原识别的灵敏性。各基因表达量最大峰值均出现在添加酶解豆粕的实验组，表明酶解豆粕对凡纳滨对虾免疫基因应答具有明显的促进效果。目前的研究表明，营养水平会在一定程度上影响机体免疫的效果，同时免疫的效果也决定着机体对营养素的需求。蛋白质水平、维生素水平、微量元素水平、饲料能量水平及免疫多糖等均会影响对虾的免疫机能和抗菌能力。有报道显示，饲料中混合褐藻多糖喂食斑节对虾(Penaeus monodon)15d后，可显著提高斑节对虾对白斑综合征病毒(WSSV)的抗病能力。饲料中添加富含核苷酸的酵母提取物使日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)淋巴器官中溶菌酶基因表达量升高，并增强其抗菌能力。研究表明，中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)饲料中添加2%VC能上调鳃组织中Toll受体和NF-κB这2个免疫基因的表达量，适量的VC能提高中国明对虾的免疫应答能力。

4 结论

综上所述，含10%鱼粉的饲料中，酶解豆粕添加量在5.5%以内对凡纳滨对虾生长性能的改善效果不显著。添加量达到5.5%时对凡纳滨对虾肌肉中粗蛋白和粗脂肪的改善效果最好。添加量达到4.5%时对凡纳滨对虾消化酶活性、对虾机体抗氧化能力和抗弧菌感染能力的改善效果最好。

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