1.3 料水比对小肽含量的影响

料水比是影响固体发酵的重要因素之一。水分含量影响发酵过程中微生物的生长。同时对酶的作用影响也比较大。由图3的结果可知，小肽的含量随着料水比的增加，呈现先增大后减小的趋势，当料水比为1：1.2时，小肽含量最高，为194.90mg／g。当料水比过大时，小肽含量呈现减少的趋势，可能是由于芽孢杆菌这类好氧菌在水分过多时生长受到抑制，从而影响了蛋白质降解成小肽。

1.4 发酵温度对小肽含量的影响

温度是影响酶活的重要因素，酶活的高低，直接影响到豆粕中蛋白质酶解成小肽。由图4的结果可知，小肽含量随温度的升高，先增加后减少，当发酵温度为40℃时，小肽含量最高，为192.73mg/g。

1.5 发酵时间对小肽含量的影响

由图5的结果可知：随着发酵时间的延长，小肽的含量先上升后略有下降，当发酵时间为48h时，小肽含量最高为182.43mg／g。当发酵时间长于48h，随着酶解时间的延长，小肽被进一步酶解生成游离氨基酸，含量反而出现下降趋势，因此酶解时间不宜过长。

2 豆粕菌酶混合发酵工艺优化

在单因素试验的基础上，得到各因素的适宜水平后，设计5因素4水平L16(45)的正交试验进行发酵工艺优化，试验因素水平编码表、试验设计及实施方案和结果见表1、表2。

2.1 正交试验结果的直观分析

从表2直观分析可以看出，极差列中接种量因素的极差值最大，所以得出结论接种量因素对小肽含量的影响最大，其次是发酵温度、料水比、发酵时间、发加酶量。发酵最优条件为A1B3C2D4E3，即接种量1.5％，加酶量450u／g，料水比1：1.4，温度40℃，时间60h。

2.2 发酵方案的确定

从正交表中观察得知最优组合为A1B3C3D3E3，与理论最优条件A1B3C2D4E3对比可知发酵时间不同，结合单因素试验结果，发酵时间过长小肽含量反而有所下降，因此对这两种方案进行3次验证试验，测得小肽含量与粗蛋白质含量见表3。

由表3可知，理论最优条件没有正交表中最优组合结果好，因此最优条件为A1B3C3D3E3，即接种量1.5％，加酶量450u／g，料水比1：1.4，温度40℃，时间48h，发酵结束后小肽含量从11.40mg／g提高到199.65mg／g；粗蛋白质从47.62％提高到56.72％。

2.3 SDS—PAGE电泳检测蛋白降解程度

将最终确定的发酵工艺的发酵产品进行SDS—PAGE检测，以原料豆粕做对照，结果见图6。图6结果显示，与原豆粕相比，发酵产品中的大分子蛋白得到有效降解，生成小分子的多肽、小肽和氨基酸，其蛋白质的分子质量在45kDa以下，小于14.4kDa的占很大一部份，由此可见，发酵后豆粕的品质得到了有效提升。

讨论

小肽的制备主要采用微生物发酵法和酶解法。从本质上讲，微生物发酵法和酶解法都是利用蛋白酶的酶解作用。微生物发酵法生产小肽的工艺主要有固体发酵和液体发酵。微生物固体发酵的优点是能较好地去除豆粕中的抗营养因子。发酵过程中加入的微生物如乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌等，其本身就是益生菌，有利于改善动物胃肠道的微生态环境，减少抗生素的应用和疾病的发生。本研究采用的是芽孢杆菌和酵母菌混合发酵豆粕，芽孢杆菌相对于霉菌来讲，生长速度较快，发酵周期较短，降低了生产成本，并且在发酵过程中分泌蛋白酶，利用蛋白酶的内切作用将蛋白质降解成低分子质量的肽，因此对豆粕蛋白有较好的降解作用；酵母菌在发酵过程中产生酒香味，使发酵产品的风味有所提升，同时酵母本身也是很好的菌体蛋白，使豆粕发酵后的粗蛋白质提高。

目前酶解法制备小肽。主要采用中性蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶(刘通讯，2002)。万琦(2003)，刘大川和钟方旭(1996)研究了5种蛋白酶：中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶的特性，筛选出碱性蛋白酶水解大豆蛋白制大豆肽，水解效果虽然较好，但是产物带有强烈的苦味，需要采取一定的脱苦工艺后方可使用。王之盛和况应谷(2004)的研究结果表明，在碱性条件下有利于豆粕抗原蛋白的降解，中碱性条件有利于7S和2S小分子质量抗原蛋白的进一步降解。本研究采用中性蛋白酶酶解豆粕，相对于碱性蛋白酶和酸性蛋白酶，避免固体发酵pH调节困难的问题，使发酵方式更为简单有效。

菌酶混合协同处理法生产小肽，充分利用微生物发酵与酶解各自的优势。发挥微生物与蛋白酶的协同作用使豆粕蛋白降解更充分，小肽化程度更高，同时避免了酶解产品的苦味，提高产品风味及适口性，进一步改善了豆粕饲用肽产品品质和营养价值。这对实现饲用肽的工业化生产具有重要的参考价值。

结论

以豆粕为原料，利用芽孢杆菌、酵母菌、中性蛋白酶混合发酵豆粕生产小肽饲料。在接种量1.5％、加酶量450U/g、料水比1：1.4、发酵温度40℃、发酵时间48h条件下。豆粕发酵后，小肽含量和粗蛋白含质量都有显著提高，小肽含量从11.40mg／g提高到199.65mg／g；粗蛋白质从47.62提高到56.72％。

实战操作技术——棉菜籽饼脱毒变身优质饲料替代豆粕操作新技术

当前豆粕价格很高有些地方货源紧缺，而棉菜籽饼（棉籽粕、菜籽粕）价格相对便宜，棉菜籽饼是棉子、油菜籽榨油后剩下的饼状残渣，蛋白质含量较高，含有各种氨基酸成分。但由于棉菜籽饼中含有植酸、芥子碱等物质，这些物质含有一定的毒性，还会影响动物的消化吸收，不能大量使用，因此不建议直接饲喂给动物！

现在通过微生物饲料发酵剂的除毒脱毒技术，可以成功将菜籽饼变为优质添加饲料，直接按照1公斤发酵的棉菜籽饼（发酵前的重量）代替约0.85公斤豆粕进行使用。饲料发酵剂中的有益微生物，在发酵过程中分泌的代谢产物，可将棉菜籽饼中的毒性物质等有效分解。

豆粕、菜粕、棉粕成分对比

1.豆粕是一种高蛋白原料，无需脱毒即可用作饲料。其中蛋白质含量为40%-48%，赖氨酸含量为2.5%-3.0%，色氨酸含量为0.6%-0.7%，蛋氨酸含量为0.5%-0.7%。2020年11月12日报价每吨在3500元左右。

2.菜粕的粗蛋白含量在34%-38%之间，特点是蛋氨酸含量高（仅次于芝麻饼、粕），赖氨酸含量亦高。而精氨酸含量低，是饼、粕饲料中含量最低的。菜籽粕的有效能值偏低（淀粉含量低、菜籽壳难以消化利用）。矿物质中，钙和磷的含量均高，硒和锰的含量亦高。特别是硒的含量是常用植物饲料中最高的。2020年11月12日报价每吨在2900元左右。

3.棉粕蛋白质含量一般为44.32%，仅次于豆粕的蛋白质含量48%，而高于菜籽粕的蛋白质含量36.04%。精氨酸含量高达3.6%-3.8%，而赖氨酸含量仅有1.3%-l.5%，只有豆粕的一半。2020年11月12日报价每吨在3000元左右。

是否需要脱毒处理

1.豆粕无需经过脱毒即可用作饲料。而且豆粕中富含蛋白质和多种氨基酸，在不需要额外加入动物性蛋白的情况下，仅豆粕中含有的蛋白质和氨基酸足以平衡家禽和猪的食谱，促进它们的营养吸收。只有当其他粕类单位蛋白成本远低于豆粕时，豆粕才有可能被替代。

2.菜粕菜籽中含有硫葡萄糖苷、芥酸、单宁、皂角苷等不良成分，其中主要是硫葡萄糖苷。硫葡萄糖苷本身无毒，但在一定温度和水分条件下，经过菜籽本身含有的芥子酶的酶解作用而产生异硫氰酸酯、唑烷硫酮和腈类等有害物质。这些物质可引起甲状腺肿大，从而造成动物生长速度下降，繁殖力减退。单宁则妨碍蛋白质的消化，降低适口性。而芥酸阻挠脂肪代谢，造成心脏脂肪蓄积及生长受到抑制。。使用前需进行一定的脱毒处理，并且使用时要加以限制，具体喂量应根据菜粕中有害成分含量而定。经过脱毒处理的菜籽粕喂量可以加大，而“双低”油菜籽生产的菜粕喂量要受限制。同时，应结合菜粕的氨基酸组成特点，适当搭配其它饼粕。

3.棉籽中含有对动物有害的棉酚及环丙烯脂肪酸，尤其是棉酚的危害很大。在制油过程中，由于蒸炒，压榨等热作用，大部分棉酚与蛋白质、氨基酸结合而变成结合棉酚，结合棉酚在动物消化道内不被动物吸收，故毒性很小。另一部分棉酚则以游离形式存在于饼、粕及油品中，这部分游离棉酚对动物毒性较大，尤其单胃动物过量摄取或摄取时间较长，可导致生长迟缓、繁殖性能及生产性能下降，甚至导致死亡。幼小动物对棉酚的耐受能力更低。由于棉籽饼、粕中游离棉酚对动物有害，因此，在使用棉饼、粕时，要根据饲喂对象及饼粕中游离棉酚的含量加以限量。反刍家畜在有优质粗料及多汁青料的情况下，棉籽饼、粕的用量不受限制，不会造成中毒。对单胃动物要限制喂量，最好使用经过脱毒处理的棉籽饼粕。同时，使用棉籽饼、粕配制饲粮要注意氨基酸平衡，尤其是棉籽饼、粕的赖氨酸含量低，且利用率差，应注意添加赖氨酸。

发酵操作技术

发酵棉菜籽饼其实也是一个脱毒技术，具体操作如下：

1.仔细检查棉菜籽饼，剔除棉菜籽饼中严重变质发霉的部分，轻度发霉的原料可以忽略，因为微生物发酵能够脱霉。

2.将棉菜籽饼粉碎并添加适量的玉米粉淀粉类的能量饲料等，调节饲料营养比例。

3.每吨棉菜籽饼加入2公斤食盐、玉米粉（其它淀粉、面粉次粉等也可以，或者粉碎的生红薯300公斤也可以）100公斤、“99多功能饲料发酵剂”1包（500g/包，市场售价约25元，以高浓度乳酸菌、酵母菌、复合酶制剂的专业发酵剂）。

4.在混合物料中添加适量水分，使混合物料含水量保持在55%左右，以“手抓一把并紧握，无水滴落，松手后轻触即散”为宜，一般上述配方中需要加入清水约500-600公斤。

5.发酵方式根据实际环境条件各异，在桶、缸、塑料袋等容器中发酵均可。

6.发酵时要尽可能排尽空气进行密封发酵。如果使用的发酵容器有密封不严实的隐患，要在一开始就在其外层包裹一层塑料袋并扎紧。发酵过程中不能启封。

7.发酵时间受环境温度影响，通常夏季发酵2-3天，冬季发酵5-7天即可完成。发酵完成后，有较为强烈的酸香味，ph值在3-4。

规模运用混合发酵现场

塑料缸、饲料袋（有内膜）均可做发酵饲料

采用池子发酵

发酵完成的棉菜粕饲喂动物技术

需要注意的是，发酵后的饲料酸度较低，不可以取代禽畜全部日粮。其他类发酵饲料同理。饲喂时根据不同情况，将发酵饲料按照一定比例添加到日粮中，发酵完成的棉菜粕为湿料，具体使用量每大概1.5-2公斤发酵棉菜粕（湿料）代替动物日粮配方中1公斤豆粕的使用量进行代替使用，与其它饲料混合后直接饲喂，由于棉菜籽粕蛋白较高，最高使用量不要超过禽畜日粮饲喂量的40%（湿料重量）。如果发现发酵饲料过酸适口性变差，可在饲喂前在阳光下晒1-2小时，或添加适量的碳酸氢钠（小苏打）即可改善。

发酵过程中与发酵后使用过程中，发酵的容器要一直保持密封状态，可以长时间保存（一年左右）。

当前养殖业成本高居不下，而饲料成本是其中最高的，利用廉价原料发酵饲料（包括一些轻度发霉的粕类低价收回）是极佳解决办法。通过微生物饲料发酵剂的发酵作用，可以将轻度霉变饲料变成优质饲料，将不易消化的物质分解为可被畜禽吸收的小分子糖类、氨基酸等。同时发酵饲料中富含有益微生物、酶制剂、酸化剂等，可调节畜禽肠胃微生态环境并进一步提高饲料利用率。发酵饲料气味清香，提高了饲料的适口性，加上发酵饲料中有大约4℃的酒度，能够促进动物新陈代谢促进健康抵御疾病，是当前养殖业发展中重要的一环。

本技术也可以同样发酵菜籽粕（饼）、棕榈粕等，方法同上。

【视频】部分发酵饲料养猪鸡鸭带给你无臭味健康无抗养殖效果

相关链接：99多功能饲料发酵剂——高浓度乳酸菌为主的固态饲料发酵剂，更轻易成功、效果更好的生物饲料发酵剂，简单好用的中草药发酵剂

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2020年已全面禁抗，我们之前经常在饲料中添加的抗生素进行促生长行为将是违法，否则面临巨额罚单。如何既能够促进动物生长又能够形成无抗养殖呢？其实中草药在促进畜禽养殖健康和生长、改善肉蛋奶品质大有可为，特别是将中草药发酵后效果提升4-28倍等好处，这个实施方案比你想象中效果更好，运用的没有不被效果折服的，值得尝试验证

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相关链接——农业农村部鼓励企业和研发机构加快生物饲料、酶制剂、益生菌、植物提取物等抗生素替代产品开发，推动全行业抗生素减量替代，确保畜禽产品质量安全