在奶牛生产中,较低的饲粮利用率一直是限制奶牛生产性能提高的重要因素。外源复合酶制剂是一类从生物中提取、具有酶特性的物质,它以绿色、安全、高效等优点迅速成为饲用添加剂领域的研究热点。酶制剂最初应用于单胃动物(如猪、鸡等),有利于改善其饲粮利用率和生产性能,而在反刍动物上的应用研究起步相对较晚,起初研究者认为酶制剂会受到瘤胃内微生物的破坏而失活。近年来的研究发现,外源酶能够在瘤胃内稳定存在,这再次引起研究者在反刍动物上使用外源酶制剂的兴趣。有研究结果表明,添加外源酶制剂有利于提高饲粮的消化率,增加奶牛产奶量及乳品质。但也有报道认为酶制剂对奶牛生产性能无显著影响。酶制剂的应用效果与酶制剂的种类、添加方式、剂量和生产方法等因素有关。单一酶制剂由于功能单一,所以效果不佳,现在多用复合酶制剂。目前复合酶制剂在奶牛上的研究较多的是降解植物细胞壁成分的纤维素酶和木聚糖酶,有关纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、果胶酶和中性蛋白酶共同制成的复合酶制剂的应用效果研究较少。本试验采用的纤维素酶是经过生物工程改造后的二代里氏木霉,再配合木聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、果胶酶和中性蛋白酶制成复合酶制剂,研究该复合酶制剂对奶牛瘤胃发酵、营养物质表观消化率、血清生化指标和生产性能的影响,同时探讨其在泌乳奶牛饲粮中的适宜添加量,为其在生产中应用及作用机理研究提供参考。

1.1 试验材料

本试验所用外源复合酶制剂由宁夏某公司提供,主要成分包括纤维素酶15 000 U/g、木聚糖酶100 000 U/g、β-葡聚糖酶280 000 U/g、甘露聚糖酶2 500 U/g、果胶酶60 000 U/g和中性蛋白酶2 000 U/g。

1.2 试验动物及试验设计

根据体重、胎次、泌乳天数和产奶量相同或相近的原则, 选择32头健康荷斯坦泌乳早期奶牛, 采用随机区组试验设计分为4组, 每组8头, 每头即1个重复, 对照组饲喂不添加复合酶制剂的基础饲粮, 试验组分别饲喂在基础饲粮中添加0.10%、0.15%和0.20%复合酶制剂的试验饲粮。先将复合酶制剂根据试验设计的添加量与精料混合均匀, 再与粗饲料混合均匀制成全混合日粮饲喂奶牛。试验预试期10 d, 正试期56 d。试验牛基本情况见表1。

1.4 样品采集及指标测定

1.4.1 采食量和相关指标测定

采用Insentec自动采食系统自动记录每天采食量。试验期每周采集2次饲粮, 测定饲粮中干物质 (DM) 含量, 根据每天记录的采食量、产奶量, 计算干物质采食量 (DMI) 和饲料转化率 (FCR) 。参照国家标准的方法测定DM、粗蛋白质 (CP) 、中性洗涤纤维 (NDF) 、酸性洗涤纤维 (ADF) 和粗灰分 (Ash) 含量, 根据粗灰分含量计算有机物 (OM) 含量。

1.4.2 瘤胃液采集和相关指标测定

正试期第54天, 于晨饲后1 h, 使用胃管式瘤胃液采样器 (MDW-15, 上海硅狄公司) 从口腔采集瘤胃液100 mL, 经4层纱布过滤后, 立即采用pH计 (SevenGo™ pH-SG2型, 上海绽兴仪器科技有限公司) 测定pH, 然后分装于10 mL离心管中, 置于-20℃保存, 用于测定瘤胃液中氨态氮 (NH₃-N) 、微生物蛋白 (M CP) 和挥发性脂肪酸 (VFA) 含量。NH₃-N含量采用苯酚-次氯酸钠比色法在酶标仪 (Thermo Electron Varioskan Flas, 上海辅泽商贸有限公司) 上测定, MCP含量采用嘌呤碱基法在酶标仪上测定, VFA含量采用气相色谱仪 (Agilent-6890N型, 北京北分天普仪器技术有限公司) 测定。

1.4.3 血样采集和相关指标测定

正试期第54天, 于晨饲前1h, 使用真空采血管尾静脉采血10 mL,将采集的血样放入离心机 (Himac-CR22G型) 2 000×g离心10 min, 用吸管取上层血清于2 mL离心管中, 置于-20℃保存。血清样品送至华英生物科技有限公司采用迈瑞BS300型生化分析仪 (北京迈润医疗医疗器械有限公司) 测定尿素氮 (UN) 、葡萄糖 (GLU) 、肌酸酐 (CR) 、总蛋白 (TP) 、白蛋白 (ALB) 、总胆固醇(TC)和β-羟丁酸 (BHAH) 含量。

1.4.4 产奶量和乳成分测定

采用美国Bou Matic自动挤奶系统记录产奶量,并计算3.5%乳脂校正乳产量。正试期每周采集1次新鲜奶样,早、中、晚按4∶3∶3比例采集50 mL, 加1粒重铬酸钾防腐,送北京市奶牛中心,采用多功能乳成分分析仪(Milko Scan 605,FossElectric,Hillerod,丹麦)测定乳糖率、乳脂率、乳蛋白率及体细胞数(SSC)。

1.4.5 粪样采集和营养物质表观消化率测定

正试期第54~57天进行奶牛消化试验。采用直肠采粪法,连续采集粪样12次,采集时间点为第54天的08:00、14:00、20:00,第55天的02:00、10:00、16:00、22:00,第56天的04:00、12:00、18:00、24:00,第57天的06:00。采样结束后,将每头牛的各个时间点粪样混合,缩成2份样品,每份500g,一份立即用10%的盐酸进行固氮,用于CP含量测定,另一份不固氮,用于其他营养物质含量测定。消化试验结束后将每头牛3d的样品混合,缩样,之后置于65℃烘箱里烘至恒重,再放入空气中回潮,粉碎后过40目筛,即得风干样品,用于营养物质表观消化率的测定。营养物质表观消化率以酸不溶灰分(AIA)为内标,采用内源指示剂法测定DM、CP、NDF、ADF和OM的表观消化率。

某营养物质表观消化率(%)=

100×［1－(A×D/B×C)］，

式中:A为饲粮中AIA含量(g/kg);B为饲粮中该营养物质含量(g/kg);C为粪中AIA含量(g/kg);D为粪中该营养物质含量(g/kg)。

1.5 统计分析

试验数据利用SAS 9.2软件包中的PROCMIXED程序进行方差分析。添加量对试验结果的影响进行线性和二次相关关系显著性检验,试验结果以最小二乘均值表示。P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。

2结果与分析

2.1 复合酶制剂对奶牛瘤胃发酵的影响

由表3可知,与对照组相比,饲粮中添加0.15%复合酶制剂能显著提高总挥发性脂肪酸(TVFA)含量(P<0.05);添加复合酶制剂有降低pH(P=0.09)和提高乙酸含量(P=0.08)的趋势。此外,与对照组相比,丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸、异戊酸、氨态氮和MCP含量均未受到复合酶制剂的影响(P>0.05),但MCP含量有线性增加趋势(P=0.05)。

3.1 复合酶制剂对奶牛瘤胃发酵的影响

VFA是饲粮中碳水化合物在瘤胃发酵的主要产物, 不仅是机体所需碳架的主要来源, 也是机体维持生长、繁殖和泌乳的重要能量来源, 可为泌乳奶牛提供所需能量的70%~80%。因此, VFA含量变化可在一定程度上反映瘤胃发酵类型和反刍动物对饲粮中营养物质的吸收利用情况。贾仙宝在饲粮中添加外源纤维素酶饲喂奶牛, 结果发现添加0.1%纤维素酶显著提高瘤胃VFA含量;李朝云报道, 在奶牛高粗饲粮和中粗饲粮中添加纤维素酶, 瘤胃VFA含量要高于高精饲粮和对照组;陈宇通过对湖羊瘤胃发酵的研究, 发现在饲粮中添加20 mg/kg外源酶时效果最佳, 瘤胃VFA含量比对照组显著增加了37%;Arriola等发现, 添加纤维酶使奶牛瘤胃液中TVFA含量增加, 乙酸/丙酸下降。因此, 酶制剂对瘤胃VFA产量的作用效果与酶制剂的种类、添加量、饲粮精粗比和试验动物种类等因素有关。在本研究中发现, 饲粮中添加0.15%复合酶制剂能显著影响TVFA含量, 且乙酸含量也有增加趋势, 这与前人研究结果一致。

NH₃-N是瘤胃微生物合成MCP和机体蛋白质的主要原料, 其含量可反映在特定饲粮下蛋白质降解与合成间所形成的一个平衡状态。NH₃-N和MCP含量也反映了瘤胃微生物对饲粮营养物质利用的程度。一般认为, 添加酶制剂通过增加瘤胃微生物的数量来促进瘤胃发酵。呼和等发现, 外源酶制剂显著提高奶牛瘤胃微生物菌群数量, 如黄化瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、溶纤维丁酸弧菌、产琥珀酸丝状杆菌和反刍兽真细菌等的数量;Yang等研究发现, 在奶牛饲粮中添加纤维素酶和木聚糖酶, 不但提高了NDF的消化率, 而且MCP产量也相应增加, 这与本试验结果一致。

饲料转化率=3.5%乳脂校正乳产量/干物质采食量。FCR=3.5%FCM yeild/DMI.

瘤胃pH是反映瘤胃发酵的综合指标, 适宜VFA形成的pH为6.2~6.6;适宜NH₃-N利用的pH为5.7~6.2。在本试验中, 瘤胃液pH有下降趋势, 这可能由于添加复合酶制剂促进TVFA的形成, 导致瘤胃液pH降低, 但各组pH均处于正常范围内。

3.2 复合酶制剂对奶牛营养物质表观消化率的影响

有研究表明, 复合酶制剂不仅可以增加瘤胃中纤维降解酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶等酶的活性, 还可增加小肠中纤维降解酶和木聚糖酶的活性。因此, 消化道内酶活性的增加为饲粮中营养物质的利用提供了保障。徐学文等报道, 饲粮中添加4种商业复合酶制剂饲喂奶牛均能促进DM和CP的消化, 并且在一定程度上有利于提高NDF和ADF的消化率;Knowlton等在奶牛饲粮中添加以纤维素酶和植酸酶为主的酶制剂, 结果发现酶制剂能够减少粪中DM、NDF、ADF、氮 (N) 和磷 (P) 的排放, 从而提高饲粮营养物质的消化率;Peters等研究发现, 在饲粮中添加纤维素酶和木聚糖酶对DM、OM、NDF和ADF降解率均无影响。在本试验中, 饲粮中添加复合酶制剂显著提高DM和NDF表观消化率, 且随着添加剂量增加, DM、OM和NDF的表观消化率呈线性增加, 这可能是由于复合酶制剂能够依附于饲粮, 破坏植物饲料表面的纤维结构, 使饲粮释放更多的还原糖, 从而提高瘤胃中木聚糖水解菌、纤维二糖利用菌等微生物的繁殖, 进而提高饲粮利用率, 最终促进瘤胃对营养物质的消化。

3.3 复合酶制剂对奶牛DMI和FCR的影响

提高DMI和FCR对于改善动物生产性能和降低饲养成本具有重要意义。解祥学等报道, 酶制剂具有降低消化道食糜黏性、增加采食量的作用。Choct研究表明, 饲粮中添加酶可以降低禽类消化道内食糜黏性, 若酶在反刍动物上也有类似降低消化道内食糜黏性的特点, 就能够增加瘤胃食糜的流通速率, 使反刍动物的饱腹感减弱, 从而促进奶牛采食;但如果增加食糜的流通速率, 酶在瘤胃中停留时间减少, 就会导致酶缺乏足够时间来降解瘤胃中纤维物质, 而随瘤胃食糜排出的绝大部分酶在真胃环境中胃蛋白酶和低pH作用下很快失活, 因此, 酶制剂的添加水平需要控制在合理的范围内。在本试验中, 饲粮中添加0.10%和0.15%的复合酶制剂能显著提高奶牛的FCR, 使DM I有升高的趋势, 说明复合酶制剂可在一定程度上促进奶牛采食。

3.4 复合酶制剂对奶牛血清生化指标的影响

血液中ALB、TP、UN和CR含量变化共同反映了机体蛋白质代谢情况。血液中TP主要由ALB和球蛋白构成, ALB具有维持血浆的渗透压的作用, 奶牛血液中ALB正常含量在29.0~36.6 g/L, 若其长时间含量过低, 则会导致机体蛋白质缺乏;血液中的UN主要来自于饲粮中蛋白质分解和机体蛋白质分解, 当血液中UN含量升高时, 则表示机体增强了对饲粮蛋白质的利用能力, 提高了机体对蛋白质的分解作用, 反之则下降, 因此血液中UN含量变化可在一定程度上反映机体对饲粮中蛋白质的利用情况;血液中CR含量反映了机体蛋白质分解和肝脏中氮素循环的情况, CR含量增加代表着机体内蛋白质分解代谢活动增强。贾仙宝报道, 在饲粮中添加纤维素酶制剂使血液中TP、CR含量显著升高, UN含量降低, 表明酶制剂能够影响参与蛋白质代谢的相关血液指标;扈添琴在饲粮中添加酶制剂与植物甾醇复合物能提高ALB含量, 但对TP含量没有显著影响。在本试验中, 添加复合酶制剂, 血清中TP含量有升高趋势, UN含量有下降趋势, 但未达到显著水平, 这可能由于奶牛本身具有较强的自身调控能力。

TC和BHBA是脂肪代谢产物, 因此其含量变化可在一定程度上反映机体内脂肪代谢情况。扈添琴研究发现, 添加酶制剂和植物甾醇复合物使奶牛血液中TC和甘油三酯含量降低;林静等发现, 在饲粮中添加外源纤维素酶对血清中TC、BHBA含量均没有显著影响, 这与本试验结果一致。

血液中的GLU主要来源于体内肝糖原的分解和瘤胃微生物分解饲粮中碳水化合物产生的丙酸, 是机体主要的能量来源, 其含量反映机体对饲粮碳水化合物消化吸收能力的强弱。奶牛血液中GLU的正常含量为 (3.10±0.47) mmol/L。在本试验条件下, 饲粮中添加复合酶制剂对奶牛血清GLU含量没有显著影响, 但在数值上有所提高, 这与贾仙宝结果一致。

3.5 复合酶制剂对奶牛生产性能的影响

产奶量直接影响了奶牛生产效益, 如何添加酶制剂提高奶牛的产奶量也是当前的研究热点。林静等在饲粮中添加以纤维素酶、木聚糖酶和葡聚糖酶为主的复合酶制剂饲喂奶牛, 结果表明添加10和20 g/ (头·d) 的复合酶制剂能显著提高产奶量;Yang等通过在奶牛饲粮中添加0.1%和0.2%的酶制剂使产奶量显著提高了0.9和1.9 kg/d, 4%乳脂校正乳产量显著提高了0.5和2.2 kg/d, 同时表明产奶量和4%乳脂校正乳产量的提高幅度随添加量的增加而增加;而Silva等的研究结果显示酶制剂对奶牛产奶量没有显著影响。本试验发现, 0.10%组和0.15%组的3.5%乳脂校正乳产量比对照组显著提高, 且试验组的产奶量也有增加的趋势, 这可能是由于复合酶制剂促进了瘤胃发酵, 提高了营养物质的表观消化率和FCR, 从而增加了产奶量和3.5%乳脂校正乳产量。在本试验中, 随着复合酶制剂量增加, 3.5%乳脂校正乳产量呈二次变化, 这说明3.5%乳脂校正乳产量与复合酶制剂添加量密切相关。

乳脂率、乳蛋白率和乳糖率含量是评价牛奶品质的关键指标。Sutton等研究发现, 饲粮中添加复合酶制剂能够有效改善乳品质;Beauchemin等在饲粮中添加1.22和3.67 mL/kg的液体酶制剂饲喂奶牛, 结果表明乳蛋白率显著高于对照组, 分别提高了1.82%和2.13%;杨泽坤等通过在饲粮中添加复合酶制剂饲喂奶牛发现, 乳脂含量和乳蛋白率均得到显著提高;而Arriola等报道饲粮中添加酶制剂对乳品质没有显著影响。本试验结果表明, 饲粮中添加0.10%和0.15%的复合酶制剂使牛奶乳脂率比对照组显著提高了7.30%和12.70%。这可能是由于饲粮中复合酶制剂提高了瘤胃内乙酸菌和纤维分解菌等微生物的活动, 瘤胃微生物活动的增强促进瘤胃液中VFA和乙酸的产生, 而乙酸是合成乳脂的重要前体物质, 因此大量乙酸的产生有利于促进乳脂合成。在本试验中, 随着复合酶制剂量增加, 乳脂率呈二次变化, 这可能是由于复合酶制剂量与微生物总量之间存在二次变化的关系, 过量的复合酶制剂反而对产奶性能有负面作用。