生物法降解黄曲霉毒素 B1的研究进展
摘 要:全世界约25%谷物供应受真菌毒素污染,给食品和饲料工业带来巨大经济损失,严重威胁着人类健康。因此,如何高效去除黄曲霉毒素(aflatoxin,AF)成为当今亟待解决的重大问题。生物法由于具有无污染、特异性高、温和、环保等特点被广泛关注。本文对生物法降解AF进行了阐述,重点介绍了微生物和昆虫对AFB1的降解作用,并从降解酶、挥发性有机化合物及AFB1生物合成相关基因的表达论述了AFB1的降解机制,展望了生物法降解AFB1的存在问题及应用前景,为后续生物法降解AF提供理论依据。
据联合国粮农组织估计,全世界25%的谷物供应受真菌毒素污染,其中2%的粮食由于发生霉变而不能食用。农作物污染给食品工业、饲料工业和畜牧业的发展带来了重大问题,造成巨大经济损失,已引起全球的广泛关注。真菌毒素种类繁多,其中黄曲霉毒素(Aflatoxin,AF)是迄今发现农产品污染中毒性最强的一类生物毒素,对人类和动物具有极强的致突变、致癌和致畸性。玉米、小麦、高粱、花生饼、豆粕、棉籽粕、玉米秸秆等农产品因储存不当或其他原因都会污染AF,这些原料经污染后,AF含量可高达50~80 μg/kg,远高于中国规定的最高限量标准20 μg/kg。在动物生产中,一旦日粮(如小麦、麸皮、玉米、豆粕等)被AF污染,轻则导致动物体增重降低,饲料转化率下降,重则诱发肿瘤和癌症,甚至死亡,造成严重的经济损失。人类摄入AF后,被细胞色素P450酶代谢形成活性中间体,与肝细胞相互作用引起肝癌。因此防止储存过程中原料发生霉变是食品与饲料生产过程中的必要环节,同时对于已发生霉变的食品与饲料原料,如何高效去除AF就成为当今亟待解决的重大问题。本文对生物法降解AF进行了阐述,重点介绍了微生物和昆虫对AFB1的降解作用及降解机制,为后续生物法降解AF提供理论依据。
1AF的去除
AF有二十多种,常见的有AFB1、AFB2、AFG1和AFG2。其中AFB1的毒性最强,因此被用来作为AF的评价指标。目前市场上常用的降解AF的方法主要有物理方法,化学方法和生物方法。物理法通过高温加热、紫外线照射等使AFB1结构破坏或通过吸附剂将AFB1吸附从而达到去除AFB1的效果。MARKOV等利用5-kGy γ-射线对47个污染的玉米样品进行照射,AFB1去除率可达69.8%,而经10-kGy γ-射线照射后,AFB1的去除率提高到94.5%。物理法操作简单,但是去除效率低且耗时。化学法去除AFB1的方法包括强氧化剂和碱处理,通过打开AFB1的某些化学键从而达到去除效果。将污染AFB1的花生放置到臭氧发生器中,熏蒸60h后,检测到89.4%的AFB1被降解。研究发现,弱碱高温处理法对花生原料中AFB1有较好的去除效果,在121℃,pH10条件下将花生粕处理60min,AFB1降解率高达84.50%,将花生油在23.42%碱浓度下进行处理,AFB1浓度从34.78 μg/kg下降到0.37 μg/kg。化学法操作简单,去除效果佳,但化学试剂会严重破坏饲料的营养物质,对饲料造成二次污染。 生物法主要是利用微生物或酶制剂进行脱毒。FARZANEH等人分离出一株枯草芽孢杆菌UTBSP1(Bacillus subtilis UTBSP1),该菌株可以降解肉汤培养基中AFB1,降解率达到85.66%。TOPCU等研究了屎肠球菌(Enterococcus faecium)降解AFB1的能力,发现在培养48h后,大约有40%的AFB1被降解。生物降解法是目前最环保最高效的降解方法,不仅可以有效降解毒素,还能提高饲料或食品的营养价值,不会造成二次污染。 2生物法降解AFB1 2.1 微生物对AFB1的降解作用 微生物法降解AFB1已经逐渐成熟,近几年,发现多种微生物对AFB1具有显著的降解作用。例如,嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、藤黄单胞菌(Luteimonas sp.)、泉水单胞菌(Silanimonas sp.)、溶杆菌(Lysobacter sp.)、乳酸杆菌(Lactobacillus sp.)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)等等。大多数研究者通过高通量如香豆素平板筛选出解毒效率高的优势菌株,表1为降解AFB1的部分菌株。
2.1.1 细菌对AFB1的降解作用
利用细菌对AFB1进行高效降解是解决AF污染的一大研究热点。WAN等观察到地衣芽孢杆菌BL010(Bacillus licheniformis BL010)具有较高的AFB1降解活性,是一种高效的AFB1降解菌株。SHU等利用香豆素培养基分离到一株具有较强AFB1降解活性的细菌,鉴定为芽孢杆菌DY3108(Bacillus velezensis DY3108),进一步研究中发现其AFB1降解活性主要来源于菌株无细胞上清液,对蛋白酶K处理具有热稳定性和抗性,对十二烷基硫酸钠处理具有敏感性,耐高温且最适pH值宽泛。KARUNARATNE等测定了三种乳酸杆菌(Lactobacillus p.)对黄曲霉菌生长和AF产生的影响,结果表明三种乳酸杆菌能有效地抑制黄曲霉菌的生长,并能有效地减少AF的产生。SANGI等分离出5株AFB1降解菌株,分别为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、两株拟灰色赭杆菌(Ochrobactrum pseudogrigonens)、铜绿假单胞菌(Pseudomon asaeruginosa)和阴沟肠杆菌(Enterobacter cloace),降解活性分别达到88%、78%、61%、58%和51%,这是首次证实了短小芽孢杆菌(Bacillu spumilus)对AFB1的降解,并首次报道了拟灰色赭杆菌(Ochrobactrum pseudogrigonens)和阴沟肠杆菌(Enterobacter cloace)具有AFB1降解活性。XU等测定了从玉米、水稻和土壤样本中采集的43个细菌菌株的AFB1降解活性,分离出活性较高的菌株L7,鉴定为沙克氏杆菌(Bacillus shackletonii)。MWAKINYALI等发现拟香味类香味菌3J2MO(Myroides Odoratimimus strain 3J2MO)能很好地降解AFB1,采用高效液相色谱-荧光检测法测定AFB1的含量,结果表明,在37℃LB培养基中培养48h后,约93.82%的AFB1被降解,该菌在农产品和食品工业基质中都有潜在的AF污染生物防治策略的生物修复和解毒作用。CHLEBICZ等研究了12株乳酸杆菌和6株酿酒酵母对AF的降解作用,乳酸杆菌平均解毒效率为60%,酵母平均解毒效率为65%。WANG等从鸡盲肠筛出一株具有AFB1降解能力的菌株,用高效液相色谱法测定AFB1降解率为93.7%,经16SrDNA基因序列分析和多重PCR鉴定为非致病性大肠杆菌CG1061(Escherichia coli CG1061)。细菌是AFB1降解菌株的主力军,但是其研究内容较为简单,只是研究了降解率、最适温度、最适pH和有效降解成分的性质,因此对细菌降解机理的还需要进一步研究。
2.1.2 真菌对AFB1的降解作用
真菌降解AF对发酵生产和饲料利用更具实际应用价值。降解AF的真菌主要包括杂色云芝(Trametes versicolor)、白腐真菌(Phanero chaete)和黑曲霉(Aspergillus niger)等。DAS等将发霉的秸秆与不同菌株进行共培养,利用高效液相色谱法测定AFB1的降解程度,发现黄曲霉MTCC2798与糙皮侧耳菌GHBBF10(Pleurotus ostreatus GHBBF10)共培养时,AFB1降解率可达89.41%,该菌株可进一步开发,有效降解发霉稻草中的AFB1。GHANBARI等研究了乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)对黄曲霉菌生长的影响,发现在30℃下孵育7d,酵母最低群体浓度为1.5×105CFU/ml时,乳酸克鲁维酵母抑制了黄曲霉的生长,并使AF的总产量降低了97.9%,其中AFB1、B2、G1、G2分别降解了97.8%、98.6%、98%和94%。WANG等对白腐菌(Phanerochaete sordida)进行研究,发现该菌可去除86.0%的AFB1。与细菌降解相比较,大多数真菌存在降解AFB1时间长、操作繁琐和降解率低的问题,大大限制了真菌在工业上的实际应用。LI等利用黑曲霉(Aspergillus niger)降解AFB1,利用液相色谱法测定AFB1含量,结果表明在处理72h后,黑曲霉对AFB1的降解率高达93.28%,其中在12h时,降解率已达到63.48%,分离菌体细胞与胞外粗提液,分别测定降解能力,发现胞外粗提液AFB1降解能力最强(84.20%),推测是由于黑曲霉细胞壁的吸附作用、胞内物质的降解作用共同去除AFB1。ZJALIC等冻干不同的杂色云芝(Trametes versicolor)提取液,通过一系列步骤提取胞外多糖和糖蛋白,添加到寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)的液体培养基中,对寄生曲霉的菌丝生长和AF的产生进行分析,结果表明其中一株杂色云芝在9d完全抑制了分生孢子的萌发和曲霉菌丝的生长,另外两株在3-6d内起抑制作用。
2.2 昆虫对AFB1的降解作用
昆虫作为一种营养丰富、高效、可持续的动物蛋白和热量来源,越来越受到人们的关注。一些昆虫由于其在特殊的自然环境下生长繁殖,能够以受到霉菌毒素污染的营养食物为能源,因此在昆虫进化过程中已经对霉菌毒素以及其它毒素产生了应对能力。NIU等发现脐橙螟对AFB1赭霉毒素A具有极高的耐受性,推测其耐受性可能是由于昆虫的解毒能力,产生了无毒的代谢产物。VAN等发现未受污染饲粮处理的黄粉虫幼虫与受污染饲粮处理的黄粉虫幼虫体重增加无差异,且存活率都较高,用LC-MS/MS分析了幼虫和幼虫粪便中霉菌毒素的存在情况,都未检出受污染饲粮或受污染饲粮衍生物,说明霉菌毒素被幼虫降解。NIERMANS等发现玉米烯酮不会在黄粉虫的幼虫体内积累,并且黄粉虫能够代谢和排泄霉菌毒素,其降解产物主要是玉米烯酮的偶联物。CAMENZULI等在黑蝇虫和黑蝇幼虫的饲料中添加AFB1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Fusarium oxysporum enol,DON)、赭霉毒素A(Ochatoxin A,OTA)和玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)的混合物,其浓度分别为欧盟委员会规定的完全饲料最高浓度的1倍、10倍和25倍,所有霉菌毒素均未在幼虫体内积累,质量平衡计算表明黑蝇虫和黑蝇幼虫对四种霉菌毒素有不同程度的代谢,其代谢物为黄曲霉毒醇,AFP1,AFQ1和AFM1,3-乙酰-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-acetyl-DON),15-乙酰-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-acetyl-DON)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-糖苷(DON-3-glycoside),α-和β-玉米赤霉烯。BOSCH等研究表明,用添加AFB1的家禽饲料喂养黑水虻幼虫和黄粉虫幼虫,其饲料中AFB1浓度分别为0.01、0.025、0.05、0.10、0.25和0.5mg/kg,对黑水虻幼虫和黄粉虫幼虫的存活率和体重没有影响,结果表明黑水虻幼虫和黄粉虫幼虫均具有较高的AFB1耐受性,且不积累AFB1。此外,黄粉虫对恶劣的生活环境适应性极强。杨军等发现黄粉虫能够将聚苯乙烯塑料完全降解矿化为CO2或同化为虫体脂肪,且以聚苯乙烯为食的黄粉虫的存活率与对照组无明显差别,首先黄粉虫将聚苯乙烯咀嚼成小碎片,并摄入肠道,摄入的片段与肠道微生物区系混合,肠道微生物区系分泌细胞外酶,催化片段解聚成小分子产物,从黄粉虫肠道筛选出一株能够将聚苯乙烯塑料作为唯一的生长营养物质的细菌,命名为微小杆菌YT2(Exiguobacterium YT2),该菌株被证实能够降解聚苯乙烯,说明肠道菌群在黄粉虫降解外源物质的过程中发挥着重要的作用一。
3生物法降解AFB1的机制
AFB1结构式中含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮,有研究表明前者为发挥毒性作用的主要基团,而后者主要与致癌性有关。目前关于物理法和化学法对AFB1降解机理的研究报道较少,大多数报道只是利用液相与质谱联用测定AFB1降解产物分子式,二级质谱对比库或利用软件推测降解产物结构式,根据产物结构分析出AFB1降解途径,而涉及生物降解AFB1机理的相关报道较多,主要包括酶降解AFB1,挥发性有机化合物对AFB1的影响,AFB1相关基因的表达等。 3.1 酶降解AFB1 酶作为AFB1降解机制研究中起催化作用的主要组成,在AFB1的生物法降解研究中占据了重要地位。WANG等利用白腐菌YK-624(Phanerochaete sordida YK-624)的锰过氧化物酶(Manganese peroxidase,MnP)对AFB1进行处理,发现86%的AFB1被去除,通过UMU试验(DNA损伤物诱导SOS反应表达umuC基因的能力)得知MnP显著降低了AFB1的致突变活性,而20 nkat MnP处理AFB1即可使其诱变活性降低69.2%,如图1所示,H-NMR和HR-ESI-MS分析表明,AFB1首先被MnP氧化成AFB1-8,9-环氧化物,然后水解成AFB1-8,9-二氢二醇,这是首次报道MnP通过将AFB1转化为AFB1-8,9-二氢二醇来有效去除AFB1的致突变活性。WAN等在对地衣芽孢杆菌BL010(Bacillus licheniformis BL010)的研究中发现并证明了其无细胞提取物在AFB1的降解中起重要作用,利用生物信息学方法发现了两个降解酶基因漆酶和几丁质酶基因(Lac010和Chia010),对Lac010和Chia010中的保守位点和可变位点进行多重序列比对,以确定在蛋白水平上的序列相似性,分析确定了这两种酶的二级结构,为后续的同源性建模和功能预测提供了重要依据,对Lac010和Chia010构建了系统发育树,结果表明Chia010与地衣芽孢杆菌几丁质酶的遗传距离较短,Lac010与枯草芽孢杆菌亚种之间的遗传距离较短。XU等在对沙克氏杆菌L7(Bacillus shackletonii L7)的研究中发现,其上清液对AFB1的降解率高于活细胞和细胞提取物,在蛋白酶K(ProteaseK)和十二烷基硫酸钠(SDS)存在下,AFB1降解率有所下降,从煮沸上清液中纯化出一种耐热酶,称为AF降解酶,这也是首次报道了从沙克氏杆菌中分离出的一种AF降解酶,它在食品和饲料加工中对AF的解毒具有潜在的应用价值。SONG等对M19型铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa M19)降解AF进行了研究,发现分别添加蛋白酶K、SDS和加热后,铜绿假单胞菌M19培养上清液的降解能力显著降低,推测存在AF降解酶,采用硫酸铵分步沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析三步程序从假单胞菌中分离出AF降解酶,使其成为一种很有前景的AFB1生物降解候选物。XIE等利是用二乙氨基乙醇-琼脂糖色谱法从泛生菌T6(Pantoea sp.T6)上清液中分里出一种胞外酶,命名为AF降解酶,用质谱法鉴定为外膜蛋白A,这是首次报道泛生菌T6可以分泌外膜蛋白A出膜并降解AFB1。
3.2 挥发性有机化合物对AFB1的影响
文献报道表明,挥发性有机化合物(Volatile organic compounds,VOCs)对真菌病原菌具有显著的抗真菌活性。一些微生物通过挥发性有机化合物的释放,如链霉菌和芽孢杆菌等,对植物病原菌显示出巨大的潜在生物作用。YANG等研究了链霉菌TD-1(Streptomyces alboflavus TD-1)中挥发性有机化合物对黄曲霉的抑菌作用,利用两个面对面无盖培养皿,将链霉菌TD-1置于下方,黄曲霉菌置于上方,结果发现挥发性有机化合物对黄曲霉菌丝生长、产孢和孢子萌发有较强的抑制作用,此前关于利用链霉菌挥发性有机化合物抑制黄曲霉的报道很少。LYU等在对链霉菌3-10(Streptomyces yanglinensis 3-10)的研究中也发现了可挥发性有机化合物在体外能抑制黄曲霉和寄生黄曲霉的菌丝生长、产孢、孢子萌发和AF生物合成基因的表达,通过扫描电镜观察表明,高剂量的可挥发性化合物可抑制两种曲霉菌在花生籽粒上的分生孢子萌发和定殖,采用固相萃取-气相色谱-质谱联用仪对19种主要挥发性有机物进行了检测,发现其中2-甲基异莰醇是主要挥发性成分,2-甲基丁酸甲酯、2-苯乙醇和β-石竹烯等3种标准化学物质对黄曲霉和寄生曲霉均具有抗真菌活性,其中2-甲基丁酸甲酯对黄曲霉和寄生曲霉孢子萌发的抑制作用最强,这是2-甲基丁酸甲酯对黄曲霉和寄生曲霉抗真菌活性的首次报导。BOUKAEW等采用同样的方式在PDA平板上上进行抗真菌生物测定,结果表明链霉菌RL-1-178(Streptomyces philanthi RL-1-178)对寄生曲霉TISTR 3276(Aspergillus parasiticus TISTR 3276)和黄曲霉PSRDC-4(Aspergillus flavus PSRDC-4)表现出抑制作用(图2),通过气相-质谱联用检测鉴定出39种化合物,其中含量最多的物质是土臭(3.75%),其次是41种L-芳樟醇(13.55%),2-巯基乙醇(9.71%)和庚烷(5.96%)。土臭素,L-芳樟醇和2-巯基乙醇完全抑制了菌丝体的生长,庚烷的抑制作用仅为45.7%。在储存的大豆种子上使用可挥发性化合物作为生物熏蒸剂,可以完全保护种子免受感染,并完全抑制AFB1、B2和G2的产生,这些发现表明,挥发性有机化合物可以用作生物熏蒸剂,以抑制储存的种子中两种真菌的生长和AF的生成。由于挥发性有机化合物的特性,有关其降解AFB1的研究逐渐增加,可挥发性有机化合物将成为生物法降解AFB1的一大热点。
3.3 AFB1生物合成基因的表达
生物法降解AFB1的研究深入到基因层面。GHANBARI等人将乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)与寄生霉菌共培养,采用实时PCR方法分析了乳酸克鲁维酵母孵育48h后β-actin和转录调控因子aflR mRNA的表达水平,β-actin结果表示寄生曲霉在乳酸克鲁维酵母存在下表现出稳定性,同时发现用1.5×105 CFU/ml浓度的乳酸克鲁维酵母处理后,转录调控因子aflR基因表达明显下降(P<0.05),表明乳酸克鲁维酵母能够抑制黄曲霉菌生物合成基因的表达。YANG等通过实时荧光定量PCR测定在挥发性有机化合物的影响下,AF生物合成的基因表达变化,结果显示在链霉菌TD-1(Streptomyces alboflavus TD-1)的可挥发性有机化合物处理下,LaeA和vea表达较对照组下降5.46倍和29.50倍,两个关键的转录调控因子aflR和aflS分别下调了6.98倍和19.27倍,并且其他四个结构基因aflD、aflM、aflP和aflQ在7.35-35.59倍范围内下调,表明可挥发性有机化合物通过影响AF生物合成的相关基因表达,直接降低AF的产生。通过研究黄曲霉菌内一系列合成AF基因的表达,揭示生物法降解AF的机理,为生物法的进一步研究奠定了基础,为基因改造降解AF的菌株提供了新的思路。
4展望
生物法由于其无污染、具有特异性高、温和、环保等优点成为近年来AF降解研究领域的热点。微生物降解AF成为研究的主要方向,但是目前报道的绝大多数微生物脱毒菌种在实际应用中存在如下两方面的共性问题:(1)有部分微生物对AFB1起吸附作用,通过食物链循环进入动物或人体,在体内发生解吸附作用,从而使AFB1进入动物或人体,造成伤害,此类微生物并没有实现生物降解,无脱毒意义;(2)已报道的菌种对AF的脱毒时间一般都在72h左右,脱毒时间较长,而且降解效率普遍较低,实践意义和应用价值不大。因此,需要寻找能够高效降解AF的菌种,真正应用到农业生产和食品安全领域。 目前,关于AF降解酶报道相对较少,大多数酶的降解率不高且用时长,导致毒素不能被完全降解。因此,利用基因工程的手段对微生物菌种进行筛选及改造,获得降解酶在体外的高效表达,开发出能够高效降解AF的生物菌种,进而为实现农作物资源的无毒化和高值化利用提供技术支持,为进一步推进我国食品与饲料安全奠定基础。
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