复合益生菌发酵鲜食大豆秸秆工艺与饲用品质的研究
我国是人口大国，对肉类的需求量很大，有必要大力发展畜牧业，然而长期以来草食畜禽饲料价格昂贵，直接导致饲养成本过高，从而影响了畜禽养殖的经济效益。开发和利用各种潜在的饲料资源对发展我国畜牧业具有十分重要的意义。我国各类农作物秸秆资源十分丰富。据估计，我国每年农作物秸秆产量达7亿多t，占世界秸秆总产量的30%。但资源利用并不合理，据初步调查，秸秆总利用率仅为百分之十几。绝大部分秸秆被闲置堆放或者焚烧处理，不仅造成极大的资源浪费和严重的环境污染，而且还导致火灾和交通事故的频繁发生。其实这些秸秆是巨大的潜在饲料资源，可以直接饲喂反刍动物，也可以作为畜禽饲料的原料。将秸秆等农副产物用作饲料不仅可以减少环境污染，还可变废为宝，解决目前饲料资源不足和价格昂贵等问题。
豆秸是豆类的副产品，每年豆秸产量达1500万t。豆秸资源长期没有得到合理有效的开发和利用，约2/3的豆秸被焚烧掉，造成资源浪费和环境污染。豆秸不能很好地用作饲料的主要原因是质地粗硬、适口性差和营养价值低。利用益生菌发酵饲料不仅能改善饲料的适口性，提高饲料的消化率，增加营养物质的吸收，而且能促进动物生长，调节胃肠道菌群，畜禽饲喂益生菌发酵饲料可以提高生产性能和抗病能力，还可以减少抗生素的使用，为人类提供健康安全的动物产品。
本文章采用复合益生菌发酵技术，研发复合益生菌发酵鲜食大豆秸秆的工艺，并探讨发酵对鲜食大豆秸秆营养价值的影响，为鲜食大豆秸秆的饲料资源化利用提供技术支撑。
1材料与方法
1.1 试验材料
研究的鲜食大豆秸秆饲料样品采集于上海市奉贤区金汇镇，品种为青酥一号，为采摘鲜食大豆豆荚后的剩余物。复合益生菌发酵液由上海创博生态工程有限公司提供，主要成分为乳酸杆菌、枯草芽胞杆菌和酵母菌等，其中活菌数≥50亿CFU/mL，乳酸菌数≥12亿CFU/mL。糖蜜由上海创博生态工程有限公司提供。
1.2 主要试剂和仪器
营养琼脂培养基和MRS培养基均购自于美国BD公司，胰蛋白酶抑制因子ELISA试剂盒购自于上海源叶生物技术有限公司，其他试剂均为国产分析纯。
紫外可见分光光度计购自尤尼科上海仪器有限公司，生物冷冻离心机购自德国Eppendoff公司，全自动凯氏定氮仪购自于美国foss公司，氧弹热量计购自于上海昌吉地质仪器有限公司，pH酸度计购自于上海精科实业有限公司。
1.3 发酵工艺
将采集的鲜食大豆秸秆通过粉碎机粉碎为0.5cm左右，调节水分含量至35%，添加5%复合益生菌菌液和不同比例的糖蜜(0、1%、3%和5%)，搅拌均匀，装入锡箔袋中(300g/袋)，每处理12袋，总共48袋。用封口机将铝箔袋真空密封后放于30℃恒温箱进行固体厌氧发酵，分别发酵0、7、15和30d，然后依次放入－20℃冰箱中保存待测。发酵结束后将发酵饲料取出一部分放于烘箱65℃烘干后粉碎过40目筛，保存供分析用。
1.4 测定指标和方法
1.4.1 饲料感官评定
从质地、颜色和气味等方面对鲜食大豆秸秆发酵饲料品质进行评定。
1.4.2 营养物质的测定
通过概略养分分析方法测定发酵饲料中营养成分的差异。
1.4.2.1 干物质
按照GB/T6435—2006的方法测定。
1.4.2.2 粗蛋白
按照GB/T6432—1994用凯氏定氮法测定。
1.4.2.3 粗脂肪
按照GB/T6433—2006用索氏浸提法测定。
1.4.2.4 粗灰分
按照GB/T6438—2007用灼烧法测定。
1.4.2.5 钙
按照GB/T6436—2002用乙二胺四乙酸二钠(EDTA)络合滴定快速法测定。
1.4.2.6 总磷
按照GB/T6437—2002用钒钼黄比色法测定。
1.4.2.7 粗纤维
按照GB/T6434—2006用酸碱醇醚洗涤法测定。
1.4.2.8 中性洗涤纤维
按照GB/T20806—2006的方法测定。
1.4.2.9 酸性洗涤纤维
按照NY/T1459—2007的方法测定。
1.4.2.10 有机物
有机物/%=干物质－粗灰分。
1.4.2.11 无氮浸出物
无氮浸出物/%=有机物－(粗脂肪+粗纤维+粗蛋白)。
1.4.2.12 干物质回收率
干物质回收率/%=发酵后饲料干物质/发酵前饲料干物质×100。
1.4.3 微生物的测定
1.4.3.1总菌数
按照GB/T13093—91进行测定。
1.4.3.2 乳酸菌数
准确称取发酵饲料10g于三角瓶中，倒入100mL无菌水，放于恒温摇床37℃，160r/min，摇动30min后稀释适当质量浓度，吸取上清液1mL于灭菌的培养皿中，然后倒入冷至50℃的MRS培养基，混匀。放于37℃恒温培养箱培养72h后，进行菌落计数。
1.4.4 pH、乳酸含量和总能的测定
1.4.4.1 pH
准确称取10g发酵饲料于三角瓶中，加入50mL无菌水，用3层医用纱布包裹后用力榨取得粗提液，过滤后用pH酸度计测定。
1.4.4.2 乳酸
参照罗建等(2012)，利用羟基联苯比色法测定。
1.4.4.3 总能
按照NY/T12—1985的方法用氧弹式热量计测定。
1.4.5 抗营养因子的测定
1.4.5.1 胰蛋白酶抑制因子
按照胰蛋白酶抑制因子ELISA试剂盒测定。
1.4.5.2 尿素酶活性
按照GB/T8622—2006进行测定。
1.5 数据分析
所有试验重复3次以上，试验所有数据采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，用Duncan氏法进行多重比较，以P＜0.05为差异显著性标准，结果用平均值±标准差表示。
2结果与分析
2.1 饲料感官评定
饲料的感官评定结果直接影响到饲料发酵效果的好坏。试验的感官评定由4 个人合作完成，以确保试验结果的准确性。发酵鲜食豆秸感官评定结果见表1，不同发酵天数和糖蜜添加量的发酵鲜食豆秸具有不同的感官评定结果。未发酵饲料质地一般、颜色为淡黄色且无酸味，发酵后的饲料质地良好、颜色为亮黄色或金黄色且有酸味。从发酵时间来看，随着发酵时间的延长，饲料质地变好、颜色变深和酸味增强; 从糖蜜添加量来看，随着糖蜜添加量的增加，饲料质地变好、颜色变深及酸味增强。从感官评定结果来看，处理12、处理15 和处理16 这3 组发酵效果最好，质地均良好，颜色均为金黄色，并且均有强酸味。肉眼观察到发酵后铝箔袋中产生大量的气体，该气体应该是复合益生菌固体厌氧发酵过程中产生的气体。
2.2 营养成分分析
发酵鲜食豆秸干物质、粗蛋白和粗脂肪测定结果见表2。发酵饲料干物质含量接近60%，各处理组干物质含量间有显著性差异(P＜0.05)，可能与初始糖蜜添加量不同有关。发酵前后饲料粗蛋白含量无显著性差异(P＞0.05)，都在13.5%左右，发酵前后饲料粗脂肪含量无显著性差异(P＞0.05)，都在2.8%左右，说明发酵过程中粗蛋白和粗脂肪含量几乎没有变化。
发酵鲜食豆秸干物质回收率、酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量见表3。干物质回收率越高表明饲料营养成分损失越少。发酵后所有处理组干物质回收率都达到98%以上，说明所有处理组营养成分损失都很少。随着发酵时间的延长，干物质回收率缓慢地减少。相同糖蜜添加量的情况下，不同发酵天数间的干物质回收率差异显著(P＜0.05)。发酵前后饲料中酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量均有显著性差异(P＜0.05)，发酵能明显减少饲料中酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量。从酸性洗涤纤维含量来看，处理8、处理11、处理12、处理15和处理16这5组含量最低，均低于42%。从中性洗涤纤维含量来看，处理组12、处理15和处理16这3组含量最低，均低于53.5%。
发酵鲜食豆秸粗灰分、钙和磷含量见表4。处理1粗灰分含量最低，约为6.98%，发酵后饲料粗灰分含量显著上升(P＜0.05)。各处理组饲料粗灰分含量也有所差异，处理12、处理15和处理16含量最高且差异不显著(P＞0.05)。处理1钙和磷含量最低，分别为1.19%和0.30%，发酵后饲料钙和磷含量显著上升(P＜0.05)。各处理组饲料钙和磷含量也有所差异，处理12、处理15和处理16含量最高且差异不显著(P＞0.05)。
发酵鲜食豆秸粗纤维、有机物和无氮浸出物含量见表5。与处理1相比，发酵能显著减少粗纤维的含量(P＜0.05)，但是不同发酵组饲料粗纤维含量差异不显著(P＞0.05)。所有处理组有机物含量都很高，均在92%以上，处理1含量最高，约为93.02%，处理8和处理11其次，处理15和处理16最低。无氮浸出物主要由淀粉、双糖和单糖等可溶性糖类组成。所有处理组无氮浸出物含量都很接近，约为35%，各处理组间差异不显著(P＞0.05)。
2.3 微生物的含量
发酵鲜食豆秸总菌和乳酸菌含量见表6。与发酵前相比，发酵后总菌数和乳酸菌含量大幅度上升且差异显著(P＜0.05)。不同发酵组总菌和乳酸菌含量也有所差异，处理15和处理16总菌含量最高，超过22亿CFU/g，乳酸菌含量也最高，约为23亿CFU/g，但是处理15和处理16总菌和乳酸菌含量相近，无显著差异(P＞0.05)。对照组总菌和乳酸菌含量很低，几乎测定不出。随着发酵天数的增加，总菌和乳酸菌含量有所升高。随着糖蜜添加量的增加，总菌和乳酸菌含量也有所升高。
2.4 pH、乳酸含量和总能变化
pH和乳酸含量是评价发酵饲料品质的重要指标。从表7可见:未发酵饲料pH约为6.51。与处理1相比，发酵后pH显著降低(P＜0.05)。不同发酵组pH也有所差异，处理15和处理16的pH最低，约为4.8并且差异不显著(P＞0.05)。发酵前后饲料乳酸含量差异显著(P＜0.05)，未发酵饲料乳酸含量很低，几乎测定不出。不同处理组乳酸含量也有所差异，但是处理15和处理16乳酸含量最高并且差异不显著(P＞0.05)。发酵提高了乳酸含量并降低了pH可能是由于随着发酵时间的延长，乳酸菌大量繁殖，从而分泌大量乳酸，进而降低pH。发酵前后饲料总能有所差异，处理15和处理16总能最高，约为19.5KJ/g且差异不显著(P＞0.05)。
2.5 抗营养因子含量
发酵鲜食豆秸胰蛋白酶抑制因子含量和脲酶活性见表8。未发酵饲料胰蛋白酶抑制因子含量最高，约为0.03mg/g。与处理1相比，发酵后饲料胰蛋白酶抑制因子含量显著降低(P＜0.05)。不同发酵组胰蛋白酶抑制因子含量也有所差异，处理12、处理15和处理16胰蛋白酶抑制因子含量最低，几乎测定不出。未发酵饲料脲酶活性最高，约为0.2mg/(g·min)。与处理1相比，发酵后饲料脲酶活性显著降低(P＜0.05)，且接近0。
讨 论
豆秸产量比玉米秸和小麦秸等其他农作物副产物产量要低，粗纤维含量很高限制了其应用，但是其粗蛋白含量很高，可以考虑作为一种非常规饲料资源进行开发利用。生产中一般采用水解、膨化和酶解等方法处理非常规饲料，由于加工技术不成熟，部分加工方式破坏了饲料的营养价值，而且加工成本还很高，缺乏竞争力。利用益生菌发酵不仅能提高蛋白质的含量，降低粗纤维含量，而且还能降低仔猪腹泻，预防肠道疾病的发生，为人们提供健康的动物产品。
据刘瑞丽等(2011)报道，利用复合益生菌发酵能提高饲料品质。廖雪义等(2009)用混合菌种发酵秸秆，终产物中粗蛋白质含量从2.2%增加到24.61%，粗纤维含量从36.2%下降到18.47%。蔡俊等(2005)将发酵饲料饲喂生长育肥猪，发现益生菌发酵饲料可改善猪的生长性能。
根椐试验，利用复合益生菌发酵鲜食大豆秸秆饲料可显著提高饲料中益生菌数量，主要是乳酸菌的数量，产生大量的乳酸，并降低饲料pH。王旭明等(2002)研究表明，复合益生菌对饲料有明显的酸化作用，能使pH明显降低。试验通过对总菌数、乳酸菌、乳酸和pH的分析得知，随着发酵时间的延长，微生物发酵厌氧程度逐渐加强，使环境更加有利于乳酸菌的增殖，从而产生大量乳酸。随着乳酸的升高，饲料pH降低，继续发酵，乳酸菌成为优势种群，从而抑制其他微生物的生长。
豆粕中存在多种抗营养因子，对动物的生长和健康能造成很多不良影响，极大的影响豆粕的饲用价值。试验中未发酵的鲜食大豆秸秆饲料中胰蛋白酶抑制因子含量和脲酶活性就很低，发酵之后发现胰蛋白酶抑制因子含量和脲酶活性几乎检测不出。马文强等(2008)利用酵母菌、乳酸菌和枯草芽孢杆菌的混菌发酵，使抗营养因子降解率达到90%。Hoffman(2003)等利用瘤胃微生物发酵除去胰蛋白酶抑制因子，降解率达到了90%以上。
复合益生菌发酵需要合适的发酵条件，发酵工艺参数包括底物含水量、菌液接种量、糖蜜添加量、发酵温度和发酵时间等。试验底物含水量选在35%，菌液接种量选在5%，发酵温度控制在30℃，糖蜜添加量选择了0、1%、3%和5%4个梯度，发酵时间选择了0、7、15和30d4个梯度，经过试验发现处理15(发酵30d，糖蜜添加3%)和处理16(发酵30d，糖蜜添加5%)发酵饲料品质最好，但是考虑到经济效益，选择处理15(发酵30d，糖蜜添加3%)为最优的发酵工艺。
4结 论
复合益生菌发酵能显著提高鲜食大豆秸秆饲料品质，并且发酵过程中干物质、粗蛋白和粗脂肪等营养物质几乎没有损失。复合益生菌发酵能降低鲜食大豆秸秆饲料中粗纤维、酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量，同时提高粗灰分、钙和磷含量。同时降低pH、胰蛋白酶抑制因子含量和脲酶活性。因此，底物含水量35%，菌液接种量5%，发酵温度30℃，糖蜜添加量3%，发酵时间30d是鲜食大豆秸秆饲料最优发酵工艺。
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