蜡样芽孢杆菌与粪肠球菌协同发酵豆粕工艺条件优化_微生物试验报告与运用_微生物知识

蜡样芽孢杆菌与粪肠球菌协同发酵豆粕工艺条件优化

2020-04-30 15:58:51 点击：

摘要：试验研究了不同发酵条件对发酵豆粕品质的影响，采用单因素优化，逐级递进法，对豆粕发酵条件进行了优化。以豆粕为原料，以益生蜡样芽孢杆菌和粪肠球菌作为发酵菌种进行固态发酵试验研究，主要考察其对发酵产物酸溶蛋白和总有机酸的影响。结果表明，豆粕固体发酵最优工艺条件为：发酵菌种比2：1（蜡样芽孢杆菌菌液：粪肠球菌菌液=2：1）、发酵初始含水量45%，发酵时间54h、好氧与厌氧时间比2：1，在此发酵条件下酸溶蛋白达到14.95%、总有机酸2.47%、抗原蛋白降解率在90%以上。

豆粕是大豆油加工的副产品，也是理想型动物饲料原料之一，营养物质丰富，其中蛋白质含量约为45%，碳水化合物约为15%，氨基酸平衡（其中赖氨酸含量最高），且价格相对低廉，在畜牧业中起着重要的作用。豆粕含有多种抗营养因子，主要分为4大类：热敏型、热稳定型、抗维生素因子、其他抗营养因子。热稳定型抗营养因子，包括植酸、寡糖、单宁、抗原蛋白，抗原蛋白以大豆球蛋白和β-伴豆球蛋白为主。发酵豆粕有助于提升豆粕风味，降解抗营养因子，增加动物对豆粕营养物质的消化吸收率。益生微生物，如乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌等，可在数量上或种类上对肠道内减少或缺乏的益生微生物进行补充，调节肠道微生物平衡，增强机体消化吸收，增强免疫力，以提高饲料转化率、畜禽生产性能及防病治病等目的，同时可以降低畜禽产品的胆固醇含量，减少硫化氢等有毒有害物质，满足畜牧业绿色、安全、可持续发展战略。本研究以豆粕为发酵原料，将豆粕经熟化后，利用益生微生物发酵，比较不同菌种对豆粕发酵后粗蛋白质、酸溶蛋白以及总有机酸的影响，获得优势菌株，并在此基础上，利用微生物协同发酵豆粕，研究不同发酵条件下，对发酵豆粕指标的影响，得出较佳发酵条件，为后期中试奠定基础。

1材料与方法

1.1 材料与试剂

豆粕（46%蛋白）由良海粮油有限公司提供；假丝酵母、粪肠球菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌由浙江科峰生物科技有限公司提供。硼酸、浓硫酸、氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾、乙醇、三氯乙酸、甲基红、溴甲酚绿、甘氨酸、TRIS等均为分析纯，购自试剂公司。

1.2 试验仪器

JY1002电子天平，上海天美天平仪器有限公司；JA1003N电子天平，上海精密科学仪器有限公司；YJ875A型超净工作台，吴江伟峰净化设备有限公司；XFLS-40MB压力蒸汽灭菌锅，浙江新丰医疗器械有限公司；202A电热恒温干燥箱，上海锦屏仪器仪表有限公司；HC-3018高速离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司；SPX-100/150/250BZ生化培养箱，上海博迅实业有限公司；CXC-06粗纤维测定仪、KDN-20C消化炉、KDN-04B凯氏定氮，浙江托普云农科技股份有限公司；DYY-6C电泳仪，北京六一生物科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 豆粕发酵菌株的筛选

分别取6kg豆粕原料，分12组，100℃熟化15min，待冷却至室温后，按接种量10%分别接种地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、假丝酵母、粪肠球菌，并补水至饲料总含水量为42%，搅拌均匀后于室温培养，即固态发酵，分为厌氧与好氧发酵，发酵时间48h，每组3个平行。将发酵48h的饲料于90℃烘干，并粉碎，过60目筛，检测粗蛋白质、酸溶蛋白（相对粗蛋白质）、总有机酸（以乳酸计）。

1.3.2 粗蛋白质的测定

粗蛋白含质量测定参照国标GB 5009.5—2016。

1.3.3 水分的测定

水分含量测定参照国标GB/T 6435—2006。

1.3.4 酸溶蛋白（相对粗蛋白质）的测定

酸溶蛋白含量测定参照国标GB/T 2653—2004。

1.3.5 粗纤维的测定

粗纤维含量的测定参照国标GB/T 6434—2006。

1.3.6 总有机酸（以乳酸计）的测定

总有机酸的测定参照国标GB/T 5009.157—2003。

1.3.7 抗原蛋白降解情况分析

十二烷基磺酸钠——聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

样品处理：取1g粉碎样品（原料和发酵样品），加入20.0mL0.03mol/L的Tris-HCl（含0.01mol/Lβ-巯基乙醇），室温下浸泡1h（每10min搅拌一次），5000r/min离心20min，取上清80μL，加入20μL5×样品缓冲液，作为上样样品，进行SDS-PAGE。对比蛋白条带，直接定性判定抗原降解情况。

1.3.8 发酵条件优化

单因素发酵条件优化试验：对菌种比例（蜡样芽孢杆菌：粪肠球菌）（1：3、1：2、1：1、2：1、3：1），发酵初始含水量（35%、38%、40%、45%、50%），发酵时间（36h、42h、48h、54h、60h）和好氧与厌氧发酵时间比（1：3、1：2、1：1、2：1、3：1）等不同的发酵条件进行研究，其中每优化一个发酵条件的最佳条件作为后续研究。

2结果与分析

2.1 不同菌株对豆粕发酵的影响（见表1）

本试验过程中，蜡样芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌起温快，其次是假丝酵母，次之为粪肠球菌，通过对发酵样品粉碎处理后，假丝酵母发酵后的豆粕气味带有独特的酵母芳香味且颜色为黄色，两株芽孢杆菌均带有氨味且颜色为深黄色至褐黄色，粪肠球菌带有乳酸香味且颜色为淡黄色。如表1所示，假丝酵母在好氧条件下，对粗蛋白质的提升优于厌氧发酵，总酸指标差于厌氧发酵；地衣芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌在好氧条件下，对提升粗蛋白质和酸溶等方面优于厌氧发酵，总酸则低于厌氧发酵总体来说，蜡样芽孢杆菌优于地衣芽孢杆菌；粪肠球菌在好氧或厌氧条件下发酵对蛋白质的提升差异不显著，但厌氧条件下总酸显著高于好氧发酵。因此，选择蜡样芽孢杆菌和粪肠球菌作为后续试验研究菌株。

2.2 不同菌种比例对酸溶蛋白和总酸的影响（见图1）

由图1可知，在好氧条件下，酸溶蛋白随着蜡样芽孢杆菌添加比例的上升逐渐增加，菌种比例达到2：1后，基本不变，此时，酸溶蛋白达到12.76%，总酸整体趋势则相反，因粪肠球菌产乳酸需要厌氧环境，此条件下，菌体生长基本被抑制，考虑到发酵风味及色泽，选择菌种添加比例为2：1作为后续研究。

2.3 发酵初始含水量对酸溶蛋白和总酸的影响（见图2）

由图2可知，豆粕中初始含水量对发酵后期酸溶蛋白和总酸的影响较大，在研究范围内，酸溶蛋白和总酸随着含水量上升，呈现正相关，含水量达到45%时，发酵48h粉碎样品颜色为褐黄色且气味略带氨味，含水量达到50%时，发酵后期，明显的氨臭味，且十分黏稠，整体感官较差，故选择初始含水量为45%作为后续研究。

2.4 发酵时间对酸溶蛋白和总酸的影响（见图3）

由图3可知，发酵时间的变化对整体酸溶蛋白含量有较大影响，而总酸影响并不大，可能是由于蜡样芽孢杆菌和粪肠球菌均可产生部分有机酸，但在好氧条件下，粪肠球菌生长被抑制，而后期由于物料黏度上升，透气性下降，出现厌氧条件，其开始生长，有机酸积累开始加快，考虑到发酵豆粕感官，以及相应的指标，选择发酵54h作为后续研究，此时，酸溶蛋白含量达到15.95%，总酸1.78%。

2.5 好氧与厌氧发酵时间比对酸溶蛋白和总酸的影响（见图4）

本试验选择54h作为发酵终止时间，结合工艺，首先进行好氧发酵，选择发酵时间：13.5、18.0、27.0、36.0、40.5h，后续采用厌氧发酵（呼吸袋抽真空），选择发酵时间40.5、36.0、27.0、18.0、13.5h。结果如图4所示，总酸随着好氧时间的增加而逐渐降低，但可以发现，时间比在1：1之后，总酸下降幅度减小，可能是由于蜡样芽孢杆菌产有机酸，弥补了粪肠球菌的产酸空白部分，酸溶蛋白则是呈现增加趋势，考虑到整体指标和感官指标，选择2：1比例较佳，此时酸溶蛋白达到14.95%，总酸达2.47%。

2.6 最佳发酵条件下发酵豆粕中抗原蛋白的降解情况分析（见图5）

由图5可知，泳道1为发酵菌比（2：1），发酵水分45%，发酵时间54h，好氧与厌氧发酵时间比（2：1）条件下，发酵豆粕粉碎成品的蛋白电泳图，抗原蛋白主要包括α-大豆球蛋白和β-伴豆球蛋白，从图中分析，几乎看不到抗原蛋白的条带，介于0%豆粕~10%豆粕原料蛋白条带之间，抗原蛋白的降解率在90%以上，故在该试验条件下，酸溶蛋白，总酸及抗原蛋白降解率均获得较佳结果。

3讨论

本试验研究了不同发酵条件对发酵豆粕品质的影响，采用单因素优化，逐级递进法，对豆粕发酵条件进行了优化。通过指标检测，获得最佳发酵条件：蜡样芽孢杆菌与粪肠球菌菌液为2：1，发酵初始含水量为45%，发酵时间54h，好氧与厌氧发酵时间比为2：1。在最佳发酵条件下酸溶蛋白为14.95%，总酸2.47%，抗原蛋白降解率在90%以上。本研究以豆粕为原料，蜡样芽孢杆菌和粪肠球菌协同发酵，拓宽了发酵豆粕的菌种选择范围，可为后期发酵豆粕的优质高效生产奠定基础。

蜡样芽孢杆菌与粪肠球菌协同发酵豆粕工艺条件优化

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