菌酶协同发酵玉米芯制备木聚糖的研究
摘要：为研究固态发酵玉米芯制备木聚糖的最佳菌酶组合条件，本试验以木聚糖含量为指标，采用单因素试验，依次研究单菌发酵、双菌发酵、菌种比例、单酶发酵、双酶发酵、双酶比例、酶的用量对发酵产物中木聚糖含量的影响。
结果表明：发酵玉米芯制备木聚糖的最佳菌酶组合条件为：枯草芽孢杆菌与酵母菌比例为1:9,发酵时添加纤维素酶量为1000U/g饲料。在此条件下，木聚糖含量可达1.421mg/g，与对照组相比显著提高了257%。
木聚糖是以β-(1，4)-D-吡喃型木糖构成主链，以4-0-甲基-吡喃型葡萄糖醛酸为支链的多糖(陈国荣等，2009)。木聚糖经酶解可用于制备低聚木糖，机体摄入低聚木糖可显著促进肠道益生菌的生长。提取木聚糖主要有以下几种方法:酸水解法(徐晓燕等，2007)、碱液提取法(石波，2001)、蒸汽爆破法（张帆，2013)、蒸煮提取法(赵建等，2004)、预处理-酶水解法(杨瑞金等，2007)等。玉米芯是制备木聚糖的理想原材料之一，据统计，我国每年有2000万吨以上的玉米芯副产物，可以为木聚糖的制备提供丰富的原料资源(孙军涛等，2015)。近年来，微生物发酵和酶解技术被应用于制备木聚糖，本试验以发酵产物中木聚糖含量为评价指标，研究单菌发酵、双菌发酵、菌种比例、单酶发酵、双酶发酵、双酶比例、酶用量对发酵产物中木聚糖含量的影响，为玉米芯的综合利用及木聚糖的制备提供理论依据。
材料与方法
1 材料
1.1 菌种
枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、酵母菌均购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
1.2 原料
玉米芯、豆粕、麸皮均购于市场，粉碎过筛。纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶均购买于济南诺能生物工程有限公司。
1.3 培养基
营养肉汤培养基，MRS肉汤培养基，麦芽汁培养基均购自广东某生物科技有限公司。固体发酵培养基：80%玉米芯，10%豆粕，10%麸皮。
1.4 仪器
JJ-CJ-1F超净工作台、TG16-WS台式高速离心机、SYQ-DSX-28OB手提式压力蒸汽灭菌器、CP224C电子天平、GX2智力光照培养箱、Epoch2酶标仪等。
2 方法
2.1 菌种的活化及种子液的制备
枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌:将冷冻保存的菌种在灭菌的营养琼脂平皿中划线，37℃培养箱培养24h。待长出菌落后，挑取单个菌落于灭菌的营养肉汤培养基中，置于摇床37℃，120r/min培养24h，即为种子液。
植物乳杆菌:将冷冻保存的菌种在灭菌的MRS肉汤琼脂平皿中划线，36℃培养箱培养24h。待长出菌落后，挑取单个菌落于灭菌的MRS肉汤培养基中，置于摇床36 ℃，120r/min培养24h，即为种子液。
酵母菌:将冷冻保存的菌种在灭菌的麦芽汁琼脂平皿中划线，28℃培养箱培养24 h。待长出菌落后，挑取单个菌落于灭菌的麦芽汁培养基中，置于摇床28℃，120 r/min培养24h，即为种子液。
2.2 试验设计
本试验玉米芯固态发酵条件为:发酵温度36℃，发酵时间72h，装料量50g，料水比1：1，接种量10%，初始pH为自然pH。以木聚糖含量为指标，采用单因素试验依次确定出最佳的发酵菌种比例和商品酶种类及用量。
2.3 木聚糖提取液的制备
固态发酵后，将发酵产物与无菌蒸馏水以1：10的比例装人三角瓶中，置于37 ℃的恒温水浴摇床以135r/min振荡1h，然后5000r/min，4℃离心10min，提取上清液待测。
2.4 检测指标
还原糖测定方法:3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)。
式中:m为还原糖的质量;M为待测产物的质量(丁胜华等，2010)。
3 数据分析
所有试验均重复三次，试验结果运用SASS 9.2软件，采用单因子方差分析(ANO-VA)并用Duncan’s方法对各组间平均数进行多重比较，P<0.05表示差异显著，用Excel 2016对数据进行整理并绘图。
结果与分析
1 单菌发酵玉米芯对发酵产物中木聚糖含量的影响
枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、酵母菌分别发酵玉米芯，发酵产物中的木聚糖含量见图1，对照组为不加菌发酵。
由图1可知，四株菌都可以增加发酵产物中木聚糖的含量，其中枯草芽孢杆菌发酵玉米芯的产物中木聚糖含量最高，为0.764mg/g，与对照组相比提高了282%(P<0.05)，故确定单菌最佳发酵菌种为枯草芽孢杆菌。
2 双菌发酵玉米芯对发酵产物中木聚糖含量的影响
枯草芽孢杆菌分别与地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、酵母菌组合发酵玉米芯，发酵产物中的木聚糖含量见图2，对照组为不加菌发酵。
由图2可知，三种菌种组合都可以增加发酵产物中木聚糖的含量，其中枯草芽孢杆菌和酵母菌组合发酵玉米芯的产物中木聚糖含量最高，为0.991mg/g，与对照组相比提高了395%(P<0.05)，故确定枯草芽孢杆菌与酵母菌的组合为发酵玉米芯的最佳菌种组合。
3 枯草芽孢杆菌与酵母菌的接种比例对玉米芯发酵产物中木聚糖含量的影响
枯草芽孢杆菌与酵母菌以不同比例发酵玉米芯，发酵产物中木聚糖含量见图3，对照组为不加菌发酵。
由图3可知，枯草芽孢杆菌与酵母菌以任何比例接种都可以增加发酵产物中木聚糖的含量，其中当枯草芽孢杆菌与酵母菌的比例为1：9时，发酵产物中木聚糖含量最高，为1.108mg/g，与对照组相比提高了454%(P<0.05)，故确定枯草芽孢杆菌与酵母菌的接种比例为1：9。
4 单酶发酵玉米芯对发酵产物中木聚糖含量的影响
发酵玉米芯时，分别添加纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶，发酵产物中的木聚糖含量见图4,对照组为不加酶发酵。
由图4可知，发酵时添加这四种酶都可以增加发酵产物中木聚糖的含量，其中添加纤维素酶的发酵产物中木聚糖含量最高，为1.319mg/g，与对照组相比提高了 231%(P<0.05)，故确定最佳发酵单酶为纤维素酶。
5 双酶发酵玉米芯对发酵产物中木聚糖含量的影响
纤维素酶分别与木聚糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶组合发酵玉米芯，发酵产物中的木聚糖含量见图5,对照组为不加酶发酵。
6 纤维素酶与木聚糖酶的比例对玉米芯发酵产物中木聚糖含量的影响
纤维素酶与木聚糖酶以不同比例发酵玉米芯，发酵产物中木聚糖含量见图6， 对照组为不加酶发酵。
由图6可知，纤维素酶与木聚糖酶以任何比例都可以增加发酵产物中木聚糖的含量，其中当纤维素酶与木聚糖酶的比例为1：0时，发酵产物中木聚糖含量最高，为1.498mg/g，与对照组相比提高了276%(P<0.05)，故确定纤维素酶与木聚糖酶的比例为1：0,即纤维素酶为最佳发酵添加酶。
7 纤维素酶的添加量对玉米芯发酵产物中木聚糖含量的影响
纤维素酶以不同添加量发酵玉米芯，发酵产物中的木聚糖含量见图7,对照组为不加酶发酵。
由图7可知，纤维素酶以任何添加量都可以增加发酵产物中木聚糖的含量，其中当纤维素酶添加量为1000U和4000U时，发酵产物中木聚糖含量最高，分别为1.421、1.446mg/g，与对照组相比分别提高了257%、263%，但差异不显著(P>0.05)，考虑到成本，故选择纤维素酶最适添加量为1000U/g饲料。
讨论
玉米芯是木聚糖含量最高的农副产品，含量为35%〜40%，是制备木聚糖的最佳原料。李里特(2004)、杨瑞金(2000)、邵佩兰等(2000)利用不同的提取方法证明，从玉米芯中提取木聚糖是可行的，而且提取率较高，罗晓风(2005)等用碱法提取木聚糖的得率为22.7%。本试验结果表明，在枯草芽孢杆菌与酵母菌比例为1：9,发酵时添加纤维素酶量为1000U/g饲料的条件下，木聚糖含量可达1.421mgg，与对照组相比显著提高了257%。
玉米芯中主要的多糖为纤维素、半纤维素和木质素，半纤维素主要是由木聚糖组成，因此半纤维素含量的高低直接决定着木聚糖的得率。由于纤维素与半纤维素、木质素等以多种物理或化学作用结合，形成致密的木质纤维结构，单纯使用酶降解玉米芯会导致酶解效率不高，生产成本增大(何亮亮，2012)。因此，要保证在实际生产中纤维素酶有较高的酶解效率，必须消除木质纤维在结构上的酶解障碍，因而在对木质纤维进行酶解之前，采用适当的方法进行预处理是必要的。常用方法之一是利用细菌、真菌等微生物的降解作用达到去除木质素，使纤维组织松散的目的。Zhang等(2007)用白腐菌处理的竹子降解后的还原糖得率是未处理样品的2.34倍，显示出较好的处理效果。枯草芽孢杆菌与酵母菌是微生物发酵技术常用的发酵菌种，都具有产纤维素酶的能力（甄玉国，2005;Antonio等，2004)，本试验通过使用枯草芽孢杆菌、酵母菌与纤维素酶协同发酵玉米芯，可以降解玉米芯中部分半纤维素使其表面出现空隙，增加酶和纤维素的可接触面积，从而提高酶解率及木聚糖产量(郑志，2012)。本试验可为菌酶协同制备木聚糖的研究提供一些理论依据。
结论
在本试验条件下，发酵玉米芯制备木聚糖的最佳菌酶组合条件为：枯草芽孢杆菌与酵母菌比例为1：9,发酵时添加纤维素酶量为1000U/g饲料。在此条件下，木聚糖含量可达1.421mg/g，与对照组相比显著提高了257%。
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