导读

随着养殖产业的大规模发展，大量增加的猪场粪便等对自然界已经造成严重污染，如果不立即采取措施，将会制约养殖业的可持续发展。以前的集约化和工厂化养殖已不能更有效地满足人类需求，而推广的生态养殖床养殖技术，是实现养殖业又好又快发展的重要措施。

至上世纪90 年代开始，为使猪肉的品质和生产性能有大的提高，中外学者对生态发酵床养猪技术做了很多的研究 。目前我国农村也大力提倡生态发酵床养殖技术，即将多种类的有益微生物比如酵母菌、放线菌、枯草芽孢杆菌等按照比例同木屑及辅助材料混合发酵，然后将形成的有机垫料铺垫在养殖圈中，当动物排泄的粪便被有机垫料吸收后，垫料中的微生物会迅速降解其中的微生物，从而达到无臭味和无害化的目的。

将生态发酵床养殖与集约化、工厂化养殖相比较后得出，生态发酵床养殖技术遵循畜禽在自然环境下按照自身原来的生长发育规律生长，而非人为地制造生长环境让畜禽违反自身原有的生长规律快速生长。发展生态发酵床养殖技术对于改善人们的生活质量和满足市场需求等都有非常重要的意义，并且能最大限度地节约自然资源，在生产无公害绿色和有机食品方面有较大的应用前景。

生态发酵养殖床中含有复合菌类，本文对其中的细菌进行研究，鉴定其属于那个菌种 。根据各种菌的培养特性，对各种营养成分的分解能力研究制作发酵床所需要的条件，使生态养殖床发酵技术有更好的发展前景。

1材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 试剂及药品

革兰染色试剂，甲基红试剂，吲哚试剂，过氧化氢，淀粉，明胶，碘，蒸馏水等 。

1.1.2 仪器及器材

AB204 － S 电子分析天平，HH － S6 数显恒温水浴锅，ＲAYW － 16 无菌涂布器，佩特里氏 630125 培养皿，YNK － 03 － 00 镍洛合金接种环，DW － 9 型自动培养基分装器，DYML － S30C 高压蒸汽灭菌锅，p H240 恒温培养箱，LWK500LT 光学显微镜，DFT － 200 小型高速粉碎机 等 。

1.2 芽孢杆菌的培育筛选

1.2.1 材料来源

用于分离菌种的样品采自兰州市榆中县夏官营镇地表层的土壤 。用已灭菌的铲子取土壤表层 10cm 下的土样，将采得的样品土壤放入已灭菌的纸袋里，带回实验室进行菌种的分离 。

1.2.2 方法

1.2.2.1 稀释涂布平板法分离

将采集的 10 g 土样加入到有 90 m L 蒸馏水的有玻璃珠的三角瓶中，缓慢晃动三角瓶使其中的土粒混匀，然后静置，吸取其中的上清液 1 m L 到无菌的试管中 。然后加入蒸馏水配制成 10－ 2浓度的悬液，再依次稀释成 10－ 3、10－ 4、10－ 5浓度的悬液，将此四个梯度各取 0.2 m L 加到p H 为 10 的营养琼脂培养皿中，使用无菌的玻璃棒进行涂布，然后放入 37 ℃ 的恒温箱中培养 2 ～ 3 d。

1.2.2.2 菌株的筛选

分别挑取菌落从上述平板上分离的部分菌体，在营养琼脂平板上划线进行分化，重复多次挑取筛选就可得到该菌株的纯种菌种 。将采用此法得到的该菌的 6 株菌分别标号为 1、2、3、4、5、6 号菌株。

1.2.3 芽孢杆菌菌种的鉴定

1.2.3.1 形态特征

个体形态: 菌体经过革兰氏染色后在光学显微镜下观察细菌的形状并测定其大小; 用芽孢染色法在光镜下观察芽孢的形状、着生位置等 。

群体形态观察: 将 1 ～ 6 号菌株分别划线接种于营养琼脂平板上，37 ℃ 培养 2 ～ 3 d，于营养培养基上接一环菌悬液涂匀后，37 ℃培养 24 h、48 h，分别革兰染色观察结果。

1.2.3.2 生化试验

使用革兰氏染色显示阳性的菌株进行糖发酵试验、甲基红试验、吲哚试验、明胶试验、淀粉试验、过氧化氢酶试验来确定最终筛选的菌株的类型。

1.3 酵母菌的分离筛选

1.3.1 材料

在附近超市购买发酵传统面粉的发酵剂 。

1.3.2 方法

1.3.2.1 酵母菌增菌培养

用天平称取 2 g 样品，在无菌条件下加至 p H 值为 4.0 的麦芽汁琼脂培养基中，30 ℃ 下培养 48 h。

1.3.2.2 酵母菌的分离与筛选

采用划线法将上述酵母菌增菌液接种到pH为 4 的麦芽汁琼脂板上，然后 30 ℃条件下培养 24 h，再从中挑出单个菌落接种到麦氏固体培养基的斜面上，培养结束后将待鉴定的菌株置于 4 ℃的冰箱中。

1.3.3 酵母菌菌种的鉴定

1.3.3.1 形态及菌落特征观察

将待鉴定的菌株接种于麦芽汁固体培养基，30 ℃ 条件下培养 3 d 后观察。

1.3.3.2 生化试验

1.3.3.2.1 糖发酵试验

在培养皿中分别加入糖发酵基础培养基，然后灭菌加入 10% 的糖液，并使糖浓度达到 2%，筛选编号为 A、B、C、D、E 的菌株接种到 30 ℃的培养基中倒置培养，培养 7 d 后判定结果。

1.3.3.2.2 不同 p H 值对酵母菌生长的影响

将酵母菌接种到 p H 分别为 4.0，5.2，6.4 的麦芽汁固体培养基上，在 30 ℃ 条件下培养 3 d，并且定期测量观察菌落的大小。

1.3.3.2.3 不同温度对酵母菌生长的影响

将培育筛选的菌株分别在 37 ℃和 30 ℃条件下培养，定时观察形态和测量菌落大小。

2结果与分析

2.1 芽孢杆菌的鉴定

2.1.1 形态特征

在营养琼脂平板上，菌落粗糙半透明，灰白色或乳白色( 如图1) ，再通过革兰氏染色镜观察芽孢杆状呈革兰阳性，菌端呈钝圆或平 。每个细胞只有一个芽孢，单个或链状排列，无荚膜以周鞭毛运动，芽孢囊不明显膨大( 如图2) 。

2.1.2 生化特征鉴定

2.1.2.1 芽孢杆菌生化试验的分析( 见表1)

本试验对土壤中分离得到的6株芽孢杆菌进行属的鉴定，结果见表1。由表 1 可以看出，革兰氏染色试验和甲基红试验、过氧化氢试验、吲哚试验、淀粉试验和明胶试验均为阳性。根据形态特征和常规的生化鉴定结果将分离出的6株菌株确定为芽孢杆菌 。

2.1.2.2 芽孢杆菌糖发酵特性的鉴定( 见表 2)

将分离到的 5 株芽孢杆菌属的菌株，进一步做糖发酵试验，结果如表 2 所示。由表 2 可知 5 株菌是同一种菌种，鉴定为芽孢杆菌。

2.2 酵母菌的鉴定

2.2.1 细胞形态及培养特征观察结果

培养基菌落大而且厚，呈乳白色、土黄色，圆形，表面光滑湿润，黏稠且扁平，边缘整齐( 如图 3) 。革兰氏染色镜检观察细胞呈圆形 。培养过程中呈多样性，增殖方式为芽殖，且为一端芽殖，细胞核清晰，细胞间无杂质碎片( 如图 4) 。

2.2.2 生化试验结果

2.2.2.1 糖发酵试验结果

2.2.2.2 不同 p H 值对酵母菌生长的影响

从表 4 可以看出，p H 值为 4. 0 时酵母菌在 24 h 内基本没有生长 。从培养 3 d 的生长总体结果看，p H 值为 5. 2 时比 p H 值为 4. 0 和 6. 4 时的各阶段菌株的生长情况更好些 。

2.2.2.3 不同温度对酵母菌生长的影响

从表 5 可以统计出，相同时间内 37 ℃条件下酵母菌的生长速度比 30 ℃时生长速度快。

3讨论

3.1 芽孢杆菌和酵母菌的讨论

芽孢杆菌生长温度范围在 15 ～ 40 ℃，其中最适生长温度为 30 ～ 37 ℃，最适 p H 范围为 7.2 ～ 7.4，它的营养要求不高，在普通琼脂培养基中就可生长，培养 24 h 就能看见灰白色表面干燥边缘粗糙的菌落并且形成芽孢 。虽然在普通培养基中不形成荚膜，但是在血清琼脂或者碳酸氢钠琼脂上，于 10% ～20% 的CO2条件下培养就可以形成荚膜 。因此，生态养殖中其内含有芽孢杆菌可以分解纤维素等，这样就不需要清除圈内家畜的粪便，可自动分解且不污染环境，再者猪还可以啃吃发酵床垫料，减少饲料的耗量，也可以提高饲料消化率 。

酵母菌含有丰富的蛋白质，可以帮助消化，在生长过程中可以形成多种 B 族维生素，这有助于其他微生物和动物的吸收和生长 。它含有超氧化物歧化酶( SOD)。SOD 是动物体内铜、锌、铁、锰的氧化酶，可以消除动物体内氧的自由基，解除游离氧对 O2-的毒性作用 。所以生态养殖中，发酵床含有酵母菌，在动物啃吃了垫料后，体内酵母菌增加，对机体有益，可以更好的生长 。另外，酸化培养基一般用磷酸或盐酸，因为有机酸在 pH 值为 3.5 ～ 4.0 时仅有部分能解离，对多数酵母菌而言大量未解离的酸是有害的 。

酵母菌通常接种在液体培养基中，通过测定培养液的混浊度来研究酵母菌的生长状况 。本文分离的菌株将用于生态养殖发酵床的研究，因此试验设计利用固体平板培养基测定酵母菌在不同温度和不同 pH 值条件下的生长状况，得到的试验数据为发酵床研究奠定了良好的基础 。

3.2 生态养殖床前景探讨

生态养殖床的养猪模式，因猪粪便被有机垫料消化分解，从而没有废弃物排出养猪场，减轻了对环境的污染，并且节约了清洁用水，猪在生态养殖床垫料上采食菌体蛋白，抗病能力明显增强了。生态养殖床中的微生物活动非常的活跃，伴随着热量的大量排放，在冬季低温时节，生态养殖床表面的温度可以达到 25 ℃，并且因其质地松软，成为猪喜爱活动和休息的场所，但是如果到高温季节时，生态养殖床设计不当则会造成温度过高而影响猪生长，所以生态养殖床的设计是十分重要的。生态养殖床的垫料除了要防止水分过大外，同时还需防止垫料过干而起尘，这个需要以猪走动不起尘土为准，生态养殖床舍还要注意通风，屋顶不低于 3.5 m，并且窗户齐全，还需要有隔热保温层。猪生态养殖床养殖是一种新的饲养模式，在生产管理中随时都会出现新的问题，管理者必须及时发现问题、解决问题，才能更好地利用微生态养殖，获得良好的经济效益。