24株鸡源丁酸梭菌的分离鉴定及耐药基因与毒力基因携带情况_微生物试验报告与运用_微生物知识

24株鸡源丁酸梭菌的分离鉴定及耐药基因与毒力基因携带情况

2020-09-01 09:35:46 点击：

摘要: 【目的】旨在对鸡源丁酸梭菌进行分离鉴定与安全性评估。【方法】利用厌氧培养方法对源自汶上芦花鸡与SPF鸡粪便样品进行丁酸梭菌的分离与纯化，挑选可疑菌落进行微生物质谱鉴定，进一步通过16S rRNA基因测序进行鉴定，16S rRNA测序结果与NCBI核苷酸数据库中丁酸梭菌的16S rRNA序列进行同源性分析；同时，进行所有分离株对氧氟沙星、头孢吡肟等9种药物的药敏试验，利用PCR方法进行mefA等23种耐药基因，基于益生菌安全要求对样品进行alpha等4种梭菌毒素基因以及typeA等4种肉毒毒素基因的测定。【结果】共分离鉴定了24株丁酸梭菌。24株均对氧氟沙星等7种抗生素表现为敏感，L-1、L-6、L-12仅对新霉素表现为中介，L-19仅对头孢吡肟表现为中介。全部菌株的mefA等16种耐药基因结果全部为阴性，sul2、flor、blaTEM3种耐药基因全部呈阳性，tetC携带率为79.2%，cmlA携带率为45.8%，blaOXA携带率为37.5%，aadB携带率为12.5%，qnrA携带率为4.2%。PCR结果显示所有分离菌株的alpha、beta、epsilon、iota等4种梭菌毒素基因携带率0%。全部分离菌株均未携带typeA、typeB、typeE、typeF4种肉毒毒素基因。【结论】结果表明，从未饲喂抗生素和丁酸梭菌的汶上芦花鸡与SPF鸡群中获得的24株丁酸梭菌分离株达到预期的安全性要求，可作为益生添加菌的筛选参考株。

丁酸梭菌归属于梭菌属，是一种产芽孢，周生鞭毛的革兰阳性菌，细胞直或稍弯，内生孢子卵圆,偏心或次端生,培养过程中发酵产酸产气。丁酸梭菌对各种外界条件的抵抗能力强，具有耐酸、耐胆盐和耐高温等特性。作为一种常见的人和动物肠道共生细菌，也经常在环境中发现。有文献指出部分丁酸梭菌会产梭菌毒素或肉毒毒素，且报道多与E型肉毒毒素有关，如：携带typeE丁酸梭菌被认为是婴儿肉毒中毒或早产儿坏死性小肠结肠炎的原因之一。丁酸梭菌是严格厌氧菌，已有研究表明丁酸梭菌出现耐氧性并可能与E型肉毒毒素基因有关，非产毒菌株目前在亚洲被用作益生菌，丁酸可增强断奶仔猪肠屏障功能，在国内2020年起饲料中禁止添加抗生素的大环境下，丁酸梭菌在畜禽生产中作为一种益生菌制剂具有良好的应用前景。依据IsaK等对丁酸梭菌CBM588进行了7毒素基因的安全性评估，以及FAO/WHO 2006年颁布的益生菌评价指南中提出益生菌耐药谱和对人体的安全的要求，我们对样品进行了更全面的8种毒力基因的PCR检测，CBM588在多次安全评估后于2014年获得欧盟批准作为食品原料。目前国内并未对丁酸梭菌进行毒素基因方面的安全性评估，所以仅以产量与抗逆性作为筛选标准可能会将携带毒素基因的菌株误作为益生添加，造成潜在风险。本研究对山东省汶上芦花鸡场与SPF鸡场分得的丁酸梭菌进行了耐药、梭菌毒素和肉毒毒素基因方面的安全性评价，分析两家鸡场内丁酸梭菌野株的耐药与毒素基因携带情况，为后续优良菌株的筛选打下基础，旨在保护动物健康。

1材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源：汶上芦花鸡的新鲜粪样24份，来自9月龄公母混养鸡群，采用随机采样；SPF鸡的新鲜粪样24份，来自231日龄公母混养鸡群，采用随机分样。两家种鸡饲料中均未添加丁酸梭菌及抗生素，丁酸梭菌A1株为从市场上某饲用菌粉中分离得到的菌株。

1.1.2 主要试剂和仪器：强化梭菌培养基（RCM）；DNA提取试剂盒（TIANGEN生化科技有限公司）；抗生素药敏片（杭州微生物试剂有限公司）；微生物质谱仪（德国BRUKER）。

1.2 菌株分离

称取每份采集的粪便样品5g与生理盐水1:9比例加入到50mL离心管中配成稀释液，震荡混匀，水浴85℃，10min后再次震荡，取稀释液1mL与RCM培养液以1:4比例加入至5mL离心管中，37℃厌氧增菌48h，再次水浴85℃，10min，重复1次RCM增菌，以三线法接种于RCM固体培养基，厌氧培养24h。

1.3 菌株鉴定

1.3.1 微生物质谱鉴定：挑选菌落边缘不规则的疑似菌落进行微生物质谱鉴定，对经微生物质谱仪鉴定结果为丁酸梭菌的菌落进行纯化增菌。

1.3.2 16Sr RNA鉴定：提取细菌基因组DNA，16S通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′）委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，对DNA进行16S rRNA的PCR扩增，PCR反应体系25μL：MIX12.5μL，ddH2O9.5μL，上下游引物各1μL，DNA模板1μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min，（95℃，30s，55℃，30s，72℃，1min40s）34×，72℃，5min。对PCR产物进行测序。16SrRNA测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对，记录与分离株比对结果最高的16S序列及其频次。

1.4 16S rRNA基因同源性分析

采用Megalign软件的CLUSTALW功能将16S rRNA测序结果与NCBI核苷酸数据中比对频次高的丁酸梭菌16S序列：KP944151.1（脓，中国北京，2015）、KC195777.1（沼气污泥，中国，2013）、MK156151.1（海洋沉积，中国，2018）、MK764959.1（中国，2019）HQ830243.1（稻田，新加坡，2011）进行同源性分析。

1.5 药敏试验

选用9种对革兰阳性菌有效的抗生素药敏片：氧氟沙星、头孢吡肟、青霉素G、新霉素、呋喃妥因、氟苯尼考、红霉素、万古霉素、四环素，以无菌棉签将增菌24h的菌液均匀涂布于RCM固体培养基上，每个20mL培养基上等距离贴三种药敏纸片，培养基37℃厌氧培养24h后量取抑菌圈直径，判定参考说明。

1.6 耐药基因测定

选用不同种类抗生素耐药基因引物大环内酯类：ermB、mefA、mrsD，多肽类：vanA、vanB、vanC1，四环素类：tetC、tetD、tetE、tetG，磺胺类：sul1、sul2、sul3，酰胺醇类：cmlA、flor，β-内酰胺类：blaPSE、blaTEM、blaSHV、blaOXA，喹诺酮类：qnrS、qnrA、oqxA，氨基糖苷类：aac（3）-Ia、aadB，共24种耐药基因，进行PCR检测，以ddH2O为阴性对照。sul1、blaSHV、blaOXA参考文献，引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及退火温度见表1。

2结果与分析

2.1 菌株的鉴定

2.1.1 微生物质谱仪鉴定：经微生物质谱鉴定结果显示分离到24株丁酸梭菌（Clostridium butyricum），部分菌株鉴定结果如表4示。

2.1.2 16S rRNA鉴定结果：BLAST结果显示24株分离株均为丁酸梭菌，其中汶上芦花鸡场分离到21株，SPF鸡场分离到3株，统计比对结果最高的NCBI ACCESSION VERSION与频次如图5所示。

2.2 菌株的培养特征

对分离到24株丁酸梭菌，汶上芦花鸡源分离株分别标记为：L-1~L-21，SPF鸡源分离株分别标记为：S-22~S-24。菌株培养产物有臭味，菌落形态呈不规则，菌落颜色在RCM培养基呈白色到黄白色，表面光滑，部分分离株如图1所示。

2.3 同源性分析

部分丁酸梭菌菌株与KP944151.1、KC195777.1、HQ30243.1、MK156151.1、MK764959.1同源性分析如图2所示，结果表明丁酸梭菌在同源性上与地理源没有明显相关性。

2.4 药敏试验结果

17株汶上芦花鸡场分离得到的丁酸梭菌与3株SPF鸡场分得的丁酸梭菌的药敏试验中对氧氟沙星、头孢吡肟、青霉素G、新霉素、呋喃妥因、氟苯尼考、红霉素、万古霉素、四环素全部表现为敏感。L-1、L-6、L-12仅对新霉素表现为中介，抑菌圈直径分别为16mm、15mm、16mm，对其他药物均表现为敏感；L-19仅对头孢吡肟表现为中介，抑菌圈直径为16mm，对其他药物表现为敏感。部分菌株药敏试验结果如图3所示，统计情况如图4所示。

2.5 耐药基因结果

PCR结果显示24株丁酸梭菌均不携带ermB、mefA、mrsD、vanA、vanB、vanC1、tetD、tetE、tetG、sul1、sul3、blaPSE、blaSHV、qnrS、oqxA、aac（3）-Ia16种耐药基因。24株丁酸梭菌全部携带有磺胺类的sul2、酰胺醇类的flor以及β-内酰胺类的blaTEM3种耐药基因；5种耐药基因结果显示为不同程度的携带，其中tetC有19株呈阳性，携带率为79.2%，cmlA有11株呈阳性，携带率为45.8%，blaOXA有9株携带，携带率为37.5%，aadB有3株呈阳性，携带率为12.5%，qnrA有1株呈阳性，携带率为4.2%，具体阳性株见表6。

2.6 梭菌毒素基因结果

PCR结果显示，汶上芦花鸡源与SPF鸡源的所有24株丁酸梭菌均不携带alpha、beta、epsilon、iota4种梭菌毒素基因中的任何一种，而从市场上某饲用菌粉中分离到的丁酸梭菌A1的alpha（α）毒素蛋白基因的PCR结果显示为阳性，且片段长度符合目的条带，如图5所示。A1PCR扩增产物测序后在Genbank中进行BLAST，与α毒素蛋白基因同源性为99.43%。

2.7 肉毒毒素基因结果

PCR结果表明，24株分离得的丁酸梭菌不携带typeA、typeB、typeE、typeF4种肉毒毒素基因中的任何一种，typeE PCR结果见图6。

3讨论

本研究从汶上芦花鸡场与SPF鸡场分得的丁酸梭菌在RCM固体培养基上呈现为大小不等的白色到黄白色、边缘不规则菌落，这与目前研究中丁酸梭菌的菌落特征相符。16S rRNA鉴定结果与质谱鉴定结果一致，表明质谱与16S rRNA均可以快速准确地完成丁酸梭菌鉴定。

16S rRNA测序结果表明，SPF鸡场的3株丁酸梭菌之间差异较显著，汶上芦花鸡场的21株丁酸梭菌之间的差异参差不齐，表明即使在同一鸡场中，丁酸梭菌也会表现出差异。易至等2020发表的论文中采用比较基因组学的方法，发现宿主源和地理来源与丁酸梭菌的系统进化没有明显的相关性；本研究基于16S rRNA序列对丁酸梭菌分离株的同源性分析结果显示，宿主源和地理来源与丁酸梭菌的系统进化无明显相关性。二者结果相符。为进行优良菌株筛选提供更多具有个性的选择。其中，L-17与KP944151.1相似性最高，为96.64%，樊晓璐等研究中丁酸梭菌与CP016332.1的梭菌属菌株的相似性为100%，廖秀冬分离得丁酸梭菌相似性最高为99%。

本次试验中丁酸梭菌分离株在耐药方面差异不大。3株SPF源丁酸梭菌对所有药物均表现敏感；汶上芦花鸡场中仅4株菌株存在对2种抗生素的中介。易至等研究中受试菌株对万古霉素表现同样为敏感，但对四环素表现出了抗性；高文文等研究中：丁酸梭菌对青霉素有抗性，对红霉素中介，而此次分离得的丁酸梭菌对青霉素G和红霉素均表现为敏感；在四环素、万古霉素结果相同为敏感。王腾浩等研究中，丁酸梭菌对新霉素有抗性，对青霉素、红霉素、氧氟沙星表现为中介，本研究24株丁酸梭菌中，3株汶上芦花鸡源分离株对新霉素表现中介；对青霉素、红霉素、氧氟沙星表现敏感；在万古霉素、四环素表现敏感。

KanekoN等人研究结果表明分得的丁酸梭菌对选用的20种抗生素中的17种不具有耐药性。而FerrarisL等从早产儿粪便分得的丁酸梭菌对万古霉素与此次试验结果都表现为敏感，但其表现出青霉素G（15%）、四环素（7.5%）的耐药。从药敏试验结果来看，证实汶上芦花鸡不饲用抗生素，与本研究前期调查结果一致，SPF鸡场也一定不使用抗生素。sul2、flor、blaTEM三种耐药基因在菌株中携带率为100%。董睿从鸡蛋源分离的沙门菌flor携带率为100%，试验结果与flor耐药基因目前只发现存在于革兰阴性菌不符；近些年多种细菌的sul2耐药基因有较高携带率，李晴分离的大肠杆菌耐药基因中blaTEM携带率为100%。5种不同程度携带的耐药基因：tetC、cmlA、blaOXA、aadB、qnrA的来源以及是否会转移有待研究，易至等就其研究中的四环素抗性结果提出丁酸梭菌可能携带有tet耐药基因，而本研究耐药基因检测结果显示tetC携带率为79.2%与其推论基本相符，但本研究中受试菌株对四环素未表现出耐药。sul2、flor、blaTEM等3种耐药基因，尤其flor是否能表达并发挥作用还需进一步验证。目前由于丁酸梭菌作为益生菌的广泛应用，本研究揭示了，未来丁酸梭菌的筛选与使用上应避免作为其成为耐药基因的储存库，以减少有害菌获得新耐药基因的几率。

本研究分离鉴定的24株丁酸梭菌均未发现携带alpha、beta、epsilon、iota等4种梭菌毒素基因，但发现市场上某饲用菌粉中分离得到的菌株A1中携带alpha毒素蛋白基因。SulthanaA等在健康人粪便中未分离到携带梭菌毒素的丁酸梭菌，IsaK等在对丁酸梭菌标准株CMB588的梭菌内也未发现梭菌毒素基因。梭菌毒素基因的检测结果初步表明本研究24株丁酸梭菌比市场上的部分产品具有更具安全性。

已有研究表明肉毒毒素基因可通过质粒转移到梭菌中，目前针对丁酸梭菌携带毒素基因的研究也以肉毒毒素基因为主。肉毒毒素基因鉴定结果显示，本研究24株丁酸梭菌均未携带肉毒毒素基因，这与GhoddusiHB等从土壤等多处分离得的93株丁酸梭菌中筛选携带E型肉毒毒素基因的研究结果一致（在93个被检测的分离株中，均未发现typeE的存在）；本研究的24株分离株的肉毒毒素基因携带率为0%，表明不会产生typeA、typeB、typeE或typeF肉毒毒素，也进一步验证了本研究24株丁酸梭菌的安全性。

4结论

结果表明，从未饲喂抗生素和丁酸梭菌的汶上芦花鸡与SPF鸡获得的24株丁酸梭菌分离株达到预期的安全性要求，可作为益生添加菌的筛选参考株。

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