1.2 乳酸菌甘露聚糖酶的结构特征

1.2.1 分离纯化及分子量

LAB甘露聚糖酶多为胞外诱导酶，液体发酵液可通过离心或过滤除去菌体获得粗酶液。甘露聚糖酶分离纯化通常采用硫酸铵分级沉淀法、透析、超滤、离子交换及凝胶过滤等方法。张鑫等使用饱和度65%的硫酸铵沉淀L.casei HDS-01甘露聚糖酶蛋白，以CH3COO－为DEAE-Sepharose Fast Flow凝胶柱洗脱阴离子，对甘露聚糖酶蛋白的洗脱效果最好，纯化后甘露聚糖酶蛋白含量为4.93mg/mL，纯化倍数提高了11.4倍。Nadaroglu等和Adiguzel等分别利用硫酸铵沉淀植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ATCCR14917TM、乳酸片球菌（Pediococcusacidilactici）M17、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）M24和绿色魏斯氏菌（Weissellaviridescens）LB37的甘露聚糖酶蛋白时，饱和度为60%~80%，洗脱阴离子为Cl－，纯化效率依次为74.5%、38.2%、75.6%和49.6%。结果表明，同种不同株来源的甘露聚糖酶在溶解度及阴离子相互吸附的能力上存在较大差别。

不同来源的甘露聚糖酶分子量也不尽相同，细菌来源的分子量通常在37~55kDa。环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）NT6.7和尼尔森杆菌（Bacillus nealsonii）甘露聚糖酶的分子量分别为40kDa和50kDa。真菌甘露聚糖酶的分子量一般较高，Chai等报道的绿木霉菌（Trichoderma virens）甘露聚糖酶分子量达到77kDa。LAB甘露聚糖酶的分子量通常为35~55kDa（表1）。L. plantarum M24有两种甘露聚糖酶组分，分别为36.4kDa和55.3kDa。因此，LAB甘露聚糖酶的分子量与细菌的甘露聚糖酶较为相近，普遍小于真菌的甘露聚糖酶。

1.2.2 酶学特性

1.2.2.1 最适反应pH值

细菌甘露聚糖酶的最适反应pH值通常在略酸性到中性范围（5.5~7.0）。真菌甘露聚糖酶作用范围一般偏酸，最适反应pH值为4.0~5.5，如里氏木霉（Trichoderma reesei）甘露聚糖酶的最适pH值为5.5。LAB中，P.acidilactici M17和W.viridescens LB37的甘露聚糖酶最适pH值均为6.0，而L.plantarum M24和L.plantarum ATCC®14917TM甘露聚糖酶的最适pH值分别为8.0和10.0。由此可以看出，LAB甘露聚糖酶的最适反应pH值可以由弱酸性到碱性，与真菌来源的甘露聚糖酶相比，其作用pH值范围更为宽泛。

1.2.2.2 最适反应温度

微生物甘露聚糖酶的最适作用温度为40~65℃。W.viridescens LB37甘露聚糖酶的最适反应温度为40℃，且该酶在30~70℃时仍保持50%以上的活性。Nadaroglu等测定P.acidilactici M17甘露聚糖酶的最适反应温度为60℃，L.plantarum M24甘露聚糖酶的最适作用温度和稳定温度范围分别为50℃和30~70℃。L.casei HDS-01甘露聚糖酶酶活最适反应温度为40℃，然而当温度升至70℃时，相对酶活下降至30%以下，这是由于高温环境破坏了α-螺旋结构的氢键，导致α-螺旋结构解旋的结果。LAB甘露聚糖酶较为宽泛的作用温度区间，提升了LAB甘露聚糖酶在工业应用中的潜力。

1.2.2.3 反应热动力学

微生物甘露聚糖酶以槐豆胶为底物时，Km值通常为0.5～7.8 mg/mL，如密褐褶菌（Gloeophyllumtrabeum）CBS900.73（Km 3.7 mgmL−1，Vmax 2525 μmolmL−1·min−1）和芽孢杆菌（Bacillus sp.）HJ14（7.8 mgmL−1，Vmax 270 μmolmL−1·min−1）。LAB甘露聚糖酶以槐豆胶为底物时，Km值通常为0.01~0.59 mg/mL，如P.acidilactici M17（Km0.592mM，Vmax 78.74 mmolmin−1mg−1）、W.viridescens LB37（Km0.0178 mM, Vmax 82.5 mgmannan mL−1）和L.casei HDS-01（Km2.68 mgmL−1，Vmax400.03 μmolmL−1·min−1）。此外，L.casei HDS-01甘露聚糖酶以瓜尔胶为底物的相对活性比对槐豆胶、果胶和魔芋粉的相对活性高出1~2倍，并且发现瓜尔胶的高亲和力和催化效率与其甘露糖和半乳糖较高比例（4：1）的组成是分不开的。

1.2.2.4 激活剂与抑制剂

金属离子如Fe3+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+或Co2+等，对甘露聚糖酶有激活或抑制作用，同种金属离子对不同来源的甘露聚糖酶产生的影响不同。Ca2+能够抑制W.viridescens LB37与L.casei HDS-01甘露聚糖酶的活性，却促进枯草芽孢杆菌亚种（Bacillus subtilis subsp.inaquosorum）CSB31嗜碱性甘露聚糖酶的活性。Zn2+能够与P.acidilactici M17和L.plantarum M24甘露聚糖酶的Zn2+结合位点结合，使酶活分别提高4%和286.3%。EDTA是一种金属螯合剂，可以通过去除金属离子以使酶失活。EDTA对L.caseiHDS-01甘露聚糖的酶活力有极强的抑制作用，经EDTA作用后剩余酶活仅在15%左右。不同来源的甘露聚糖酶性质存在显著差异，因此通过改变酶学性质，使甘露聚糖酶达到最佳状态，进而扩充LAB甘露聚糖酶的应用范畴。

2LAB表达重组甘露聚糖酶

随着对半纤维素资源的开发和功能性低聚糖MOS益生作用的研究，甘露聚糖酶的研究已取得较大程度的进展，在保健品、饲料等行业广泛应用。LAB作为甘露聚糖酶的直接产酶菌株提供了诸多便利，具有食品安全级的保障和益生作用，符合绿色、经济、环保的可持续发展理念。为使LAB来源的甘露聚糖酶能够更广泛的应用于工业化量产，需提高LAB甘露聚糖酶的环境适应性、酶活力及产酶水平等。LAB甘露聚糖酶的研究将集中在以下几个方面：第一，挖掘直接产甘露聚糖酶的LAB菌株资源，为酶的食品级应用提供生成菌种；第二，优化产酶条件，为工业化生产提供工艺参数；第三，利用分子生物学手段构建食品级表达系统，提高甘露聚糖酶的安全性及产量。