摘要：为了探究高效的羊肉蛋白的酶解工艺以及酶解液中氨基酸种类与含量，试验采用冻干羊肉粉为原材料，以酶解液中氨基酸肽氮的含量为水解度的评价指标，选择碱性蛋白酶与风味蛋白酶的添加总量和添加比例、羊肉蛋白含量、酶解温度、pH值以及酶解时间为自变量进行单因素试验，筛选部分因素进行五因素三水平的正交试验，同时测定最终酶解液游离氨基酸的种类与含量。结果表明：最佳酶解工艺为碱性蛋白酶与风味蛋白酶添加总量为5%、添加比例为1：3，酶解温度为50℃， pH值为8.0，羊肉蛋白含量为4%，酶解时间为8h，在该条件下复合酶对羊肉蛋白水解度为43.7% 。酶解液中有20种氨基酸，总含量为1 288.98 mg / 100mL；游离氨基酸含量分为4个区段，其中亮氨酸含量最高（214.42 mg/100mL），色氨酸含量最低（8.63 mg /100mL）。说明优化后的酶解工艺合理可行，且具有较好的酶解效果以及较低的时间成本。

我国是羊肉生产与消费大国，2017年，我国羊肉年生产总量为467. 5万t，年人均羊肉消费量为3. 5 kg，在所有肉类消费中羊肉占比超过5% 。目前，我国肉羊的屠宰及初加工场区大多在牧草丰富的西北地区，由于当地经济水平及监管、规范力度相对不足，使得肉羊屠宰初加工中产生大量的屠宰副产品无法得到有效的利用，肉羊屠宰副产品的处理多采用酶解法、化制法以及微生物发酵法等。目前，对于肉羊屠宰副产品处理的研究主要集中于骨、血液、内脏以及油脂等副产品，其处理产物多用于制备工业油、骨粉、肥料以及燃料等。在众多处理方法中，酶解法是最为环保、安全的方法，其中单一酶解法的酶解效果普遍较差，因此复合酶解法成为了常用的酶解方法之一。酶解法中常用的酶有碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶以及菠萝蛋白酶等。研究结果表明，木瓜蛋白酶与菠萝蛋白酶常用于植物的酶解及肉的嫩化，木瓜蛋白酶对蛋白胨的酶解效果较差，菠萝蛋白酶在水中溶解度较低且对肌纤维蛋白原酶解效果较差；碱性蛋白酶对肽键、酰胺键以及酯键等均有良好的水解效果；风味蛋白酶具有改善酶解产品质量、降低成本及提高水解度等优点，因此常用于骨/肉副产品加工等领域。综上所述，本试验提出利用碱性蛋白酶与风味蛋白酶组成的复合酶对羊肉的酶解工艺进行优化探究，选出最优酶解条件并测定酶解液中氨基酸的含量，为其在氨基酸有机肥以及饲料添加剂等方面的应用提供参考，以及为屠宰副产品的高价值二次利用提供理论依据。

1 材料

1.1供试羊肉样品与酶类

羊肉样品为兰州大尾羊屠宰过程中产生的碎肉残渣，由兰州市忠华屠宰场提供。碱性蛋白酶（40万μ/g）、风味蛋白酶（20万μ/g）。

1.2主要试剂与仪器

甲醛、氢氧化钠、盐酸、硫酸、三氯乙酸、茚三酮(均为分析纯)

2、方法

2.1羊肉样品前处理与其蛋白质含量的测定

用绞肉机搅碎肉样后，将其置于真空冷冻干燥机中，-40℃下冷冻干燥36 h，取出后罐装密封保存，备用。参照《食品中蛋白质的测定》（GB 5009. 5-2016）中的凯氏定氮法测定肉样中蛋白质含量。

2.2单因素试验及酶解体系

2.2.1单因素试验探究

碱性蛋白酶与风味蛋白酶添加总量（1%、2%、3%、4%、5%）、碱性蛋白酶与风味蛋白酶的添加比例（1：1、1：2、1：3、1：4、1：5）羊肉蛋白含量（4%、5%、6%、7%、8%），pH值（7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）、酶解温度（40，45，50，55，60℃）,酶解时间（2，4，6，8，10 h）对羊肉样品蛋白质水解度的影响。参照《食品中氨基酸态氮的测定》（GB 5009. 235-2016）中的甲醛滴定法测定肉样蛋白质水解度。

2. 2. 2酶解体系

在500mL锥形瓶中加入100mL纯化水，再按照计算公式加入冻干羊肉粉(计算公式：W1= W2/N，W1为加入冻干羊肉粉量；W2为所需粗蛋白量；N为测得冻干羊肉粉中粗蛋白的含量)，然后加入不同比例的碱性蛋白酶与风味蛋白酶(加入量按占冻干羊肉粉中粗蛋白量的百分比计算)，用0.05mol/L盐酸与0. 05mol/L氢氧化钠调整酶解体系pH值，之后将酶解体系放入恒温摇床定时反应，每个试验重复5次。

2. 3正交试验

在单因素试验基础上，以蛋白质水解度为指标，以酶解温度、pH值、羊肉蛋白含量、碱性蛋白酶与风味蛋白酶添加量、碱性蛋白酶与风味蛋白酶的添加比例为考察因素，设计L18（35）正交试验，优化酶解工艺，利用SPSS 22.0软件进一步对正交试验结果进行方差分析。

2.4验证试验

依据正交试验中得到的最佳水解条件，进行验证试验。

2.5羊肉样品酶解液中氨基酸含量的测定

按照最佳酶解条件将羊肉样品酶解后，取酶解液置于100℃水浴中灭活15 min，待酶解液冷却后用纱布粗滤，然后将样品经0.45μm滤膜过滤后静置20 min，再向1mL酶解液中加入0.25mL的20%三氯乙酸，混匀后4℃过夜。取过夜酶解液样品上清液用0.22μm膜过滤并稀释20倍后，使用全自动氨基酸分析仪进行酶解液样品中氨基酸含量的测定。

2.6数据的统计分析

采用SPSS 22. 0软件对试验数据进行统计学分析，结果均以“平均值士标准差”表示，对单因素试验采用新复极差法进行差异显著性分析，正交试验结果采用多因素方差分析法进行差异显著性分析，P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著。

3、结果与分析

3.1羊肉样品中蛋白质含量的测定

通过凯氏定氮法测定干燥后的羊肉样品中粗蛋白含量为77.4%。

3.2单因素试验

3.2.1碱性蛋白酶与风味蛋白酶添加总量对羊肉样品中蛋白质水解度的影响结果见图1。

 由图1可知，随着碱性蛋白酶与风味蛋白酶添加总量的增加，肉样中蛋白质的水解度呈先上升后略微下降的趋势，在添加量为4%时，水解度最大（36.7%），且与1%、2%、3%添加量差异显著（P

3.2.2碱性蛋白酶与风味蛋白酶的添加比例对羊肉样品中蛋白质水解度的影响结果见图2。

由图2可知，在碱性蛋白酶与风味蛋白酶的添加比例为1：2时，羊肉样品的蛋白质水解度达到最大值（36.8%），且较其他各个添加比例差异显著（P<0.05），之后随着比例升高，羊肉样品的蛋白质水解度逐渐下降，综合考虑选择复合酶添加比例1 ：1，1：2，1：3进一步优化。

3.2.3羊肉蛋白含量对羊肉样品中蛋白质水解度的影响结果见图3。

在酶浓度保持不变的条件下，一定范围内，酶促反应速率与底物浓度呈正比。由图3可知，当羊肉蛋白含量为5%时，羊肉样品蛋白质水解度达到最大值（39.5%），且与其他各浓度差异显著(P<0.05)，之后随着羊肉蛋白含量的升高，羊肉样品中蛋白质的水解度逐渐下降，综合考虑选择底物浓度4%、5%、6%进一步优化。

3. 2. 4  pH值对羊肉样品中蛋白质水解度的影响结果见图4。

 由图4可知，pH值较低时，羊肉样品蛋白质水解度随着pH值升高不断上升，在pH值为7. 5时达到峰值(41.9%)，之后随着pH值升高水解度逐渐下降，综合考虑选择pH值7.0、7.5、8.0进一步优化。

3.2.5酶解温度对羊肉样品中蛋白质水解度的影响结果见图5。

由图5可知，当温度为50℃时，羊肉样品中蛋白质水解度达到最大值(40.9%)，且较其他各温度均差异显著(P<0.05)，之后随着温度的升高水解度逐渐下降，综合考虑选择温度45，50，55℃进一步优化。

3.2.6酶解时间对羊肉样品中蛋白质水解度的影响

由图6可知：酶解时间8h内，随着酶解时间的延长，羊肉样品中蛋白质水解度较快上升，且各个时间段水解度均差异显著(P

3. 3正交试验

在单因素试验基础上，以羊肉样品中蛋白质的水解度作为指标，选择碱性蛋白酶与风味蛋白酶的添加总量和添加比例、羊肉蛋白含量、酶解温度、pH值为自变量，进行五因素三水平的正交试验，设计方案及结果见表1~3。

由表2可知，各因素对于酶解效果的影响程度为A>C>B>E>D，即碱性蛋白酶与风味蛋白酶添加总量>酶解温度>碱性蛋白酶与风味蛋白酶的添加比例>羊肉蛋白含量>pH值，酶解最佳工艺为A3B3C2D3E1，即碱性蛋白酶与风味蛋白酶添加总量5%、添加比例1：3，酶解温度50℃ pH值8.0，羊肉蛋白含量4%。

由表3可知，因素A即碱性蛋白酶与风味蛋白酶添加量对酶解工艺影响极显著(P<0.05)，因素C即酶解温度对酶解工艺影响显著(P<0.05)，说明复合酶添加量与酶解温度在酶解反应中有重要作用。

3. 4验证试验

依据正交试验中得到的最佳水解条件，进行3次平行验证试验，结果表明，在最佳水解条件下（A3B3C2D3E1）得到的水解度为43.7%，高于正交试验中的最高值42.8%，表明本研究的酶解工艺具有较高的可行性。故确定复合酶对羊肉样品蛋白质的最佳酶解工艺为碱性蛋白酶与风味蛋白酶添加量5%、添加比例1：3，酶解温度50℃ pH值8.0，羊肉蛋白含量4%，酶解时间8 h。

3. 5酶解液中游离氨基酸种类和含量的测定结果见图7。

3. 4验证试验

依据正交试验中得到的最佳水解条件，进行3次平行验证试验，结果表明，在最佳水解条件下（A3B3C2D3E1）得到的水解度为43.7%，高于正交试验中的最高值42.8%，表明本研究的酶解工艺具有较高的可行性。故确定复合酶对羊肉样品蛋白质的最佳酶解工艺为碱性蛋白酶与风味蛋白酶添加量5%、添加比例1：3，酶解温度50℃ pH值8.0，羊肉蛋白含量4%，酶解时间8 h。

3. 5酶解液中游离氨基酸种类和含量的测定结果见图7。

4、讨论

我国肉羊的饲养量及羊肉产量均居世界首位，但目前对其屠宰产生的副产品，尤其是碎肉渣的处理能力相对不足，通常是与其他副产品混合处理，使得碎肉渣的二次利用价值没有充分开发。因此，本试验提出利用复合酶酶解技术对肉羊屠宰产生的肉残渣进行酶解处理，在酶促反应中，酶的催化活性受到众多因素的影响。本试验结果表明，当复合酶的添加量达

到5%时，水解度略微下降，说明在底物一定的情况下，过量添加蛋白酶的量，会导致酶分子与底物分子结合相对困难，使得水解度出现略微下降趋势。同时，本试验结果表明，复合酶比例超过1：2且随着风味蛋白酶比例的增加，水解度出现明显的下降，这可能与碱性蛋白酶和风味蛋白酶酶切位点不同有关，碱性蛋白酶对肽键、酰胺键以及酯键等均有良好的水解效果，能更大程度将蛋白质水解为大分子肽段，而风味蛋白酶仅对肽键有较好的水解效果，因此随着风味蛋白酶添加比例的增加，水解度有一定程度的下降。

另外，酶促反应体系中，底物蛋白质含量、pH值、酶解温度、时间等均会影响酶的催化活性。底物羊肉蛋白的含量过高，会增大水解液的黏稠程度，导致蛋白酶在水解液中分布不均，抑制水解反应的进行，且过量的底物与酶分子结合，生成无活性的中间产物，会影响酶的活性。过高的pH值会改变酶分子与底物分子的带电状态，从而降低酶与底物的结合效率。温度过高或过低均会影响酶的活性，温度过低不仅影响酶活，还会使得酶与底物结合效率降低，抑制酶促反应速率，温度过高则会导致蛋白酶结构发生不可逆的破坏。长时间的酶促反应可使反应体系逐渐饱和，另一方面，水解产物使反应体系的pH值逐渐下降，酶的活性可受到一定程度的影响。因此，本试验探究了复合酶对羊肉蛋白质最佳的酶解条件，使羊肉蛋白质最大程度水解为小分子肽以及氨基酸。本试验结果表明，为保证高水解度低成本的效果，羊肉酶解工艺最佳条件为碱性蛋白酶与风味蛋白酶添加总量5%和添加比例1：3,酶解温度50℃, pH值8.0、羊肉蛋白含量4%，酶解时间8h，在此条件下水解度可达43.7%。  

 本试验对酶解产物中的氨基酸种类与含量进行了测定，发现酶解产物中含有20种氨基酸，其中亮氨酸与谷氨酸含量显著高于其他氨基酸，异亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸及天冬氨酸为中等含量，而色氨酸含量最低。可见羊肉酶解液中支链氨基酸与必需氨基酸含量较高，但支链氨基酸含量过高会带来较差的食用感受，而酶解物中较高含量的谷氨酸可以大幅度提升食用口感。大量研究结果表明，支链氨基酸作用较为广阔，是动物饲料添加剂研究的重点之一。研究发现，仔鸡日粮中添加亮氨酸以及异亮氨酸后，仔鸡肌肉增长率显著上升，同时大幅度提高仔鸡生长性能。研究结果表明，日粮中添加低剂量的支链氨基酸可以显著减少猪肠道中以及粪便中链球菌和铜绿假单胞菌的含量。研究发现，增加日粮中支链氨基酸水平能降低肉鸡料重比，适宜含量的支链氨基酸能促进肉鸡肠道生长发育。研究结果表明，日粮中合理添加氨基酸能显著提高育肥猪的生长性能，有效改善育肥猪机体的免疫能力，缩短育肥周期。说明支链氨基酸在促进肌肉增长、抗疲劳、抗肌肉损伤、促进机体发育、调整能量和微生物平衡等方面有着重要作用。由此可见，动物屠宰副产品水解产物的二次利用具有广阔的应用前景。

5、结论

本试验通过优化肉羊屠宰废弃碎肉复合酶酶解工艺，在单因素试验的基础上，通过正交试验进行优化，确定了最佳酶解工艺为碱性蛋白酶与风味蛋白酶添加总量5%和添加比例1：3，酶解温度50℃，pH值8.0、羊肉蛋白含量4%，酶解时间8h。实际水解度为43.7%，高于正交试验中的最高值42.8%。对羊肉氨基酸组成的研究结果表明，羊肉酶解液中含有20种氨基酸，支链氨基酸与必需氨基含量丰富，且有较高含量的谷氨酸，使得羊肉及其酶解产物具有非常鲜美的食用感受，因此表明羊肉酶解产物在氨基酸肥料、动物饲料添加剂等方面具有很高的应用价值。

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