1.1 试验材料

RSM:购自御康农业科技有限公司。FRSM:将RSM与麦麸按7∶3的比例混合, 然后接种10%的微生物混合菌液 (菌液活菌数≥1×10⁹CFU/mL) , 加1%红糖, 料水比1.0∶1.2。将上述物质混合均匀后, 装至发酵桶密封, 厌氧发酵72 h以上, 得到FRSM。发酵菌种:短乳杆菌 (Lactobacillus brevis) 和短小芽孢杆菌 (Bacillus pumilus) 均为本实验室保藏菌种, 菌种比例为1∶2。FRSM相比于RSM其pH下降了1.68, 营养物质粗蛋白质、水溶性蛋白、酸溶性蛋白和粗脂肪的含量与RSM相比分别提高了1.91%、52.88%、44.40%和24.27%;抗营养因子中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维的含量分别降低了5.21%、0.38%, 异硫氰酸酯降解率达到91.92%, 噁唑烷硫酮降解率达到100.00%。RSM发酵前后营养物质和抗营养因子含量变化见表1。

1.3 饲养管理

动物试验在重庆市畜牧科学院双河实验基地进行, 采用常规饲养管理, 严格执行消毒制度。试验期间, 试验猪自由采食、自由饮水, 试验期7周。

1.4 样品采集与测定指标

1.4.1 生长性能的测定

试验猪在试验开始和结束时分别于早晨空腹称重, 试验期间记录每个重复的饲粮消耗, 计算平均日采食量 (ADFI) 、ADG和F/G。

1.4.2 血清生化指标的测定

试验结束空腹称重后, 以各组别每个重复为单位, 每组选取6头猪进行前腔静脉采血。血样经3 500 r/min离心10 min, 分离所得血清分装于Eppendorf管中, 置于-20℃冷冻保存, 待测。

血清葡萄糖 (GLU) 、总胆固醇 (T-CHOL) 、总蛋白 (TP) 、尿氮 (UN) 、甲状腺素 (T₄) 和三碘甲状腺原氨酸 (T₃) 含量由重庆市荣昌县永荣医院协助检测, 试剂盒购自南京建成生物工程研究所, 测定仪器为Glamour 2000全自动生化分析仪。

1.4.3 抗氧化能力指标的测定

血清超氧化物歧化酶 (SOD) 活性用黄嘌呤氧化酶法测定, 血清谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 活性用比色法测定, 血清总抗氧化能力 (T-AOC) 用Fe³⁺还原法测定, 血清丙二醛 (MDA) 含量用硫代巴比妥酸法测定。试剂盒购自南京建成生物工程研究所, 测定仪器为U-3900型分光光度计, 具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.4.4 免疫功能指标的测定

血清免疫球蛋白 IgA、IgG、IgM和肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 含量均采用酶联免疫吸附试验 (ELISA) 试剂盒测定。试剂盒购自南京建成生物工程研究所, 测定仪器为华东电子DG5033A酶标仪, 具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.5 数据处理

试验结果用Excel 2010对数据进行初步处理, 再用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析, 若有显著差异则用Duncan氏法进行多重比较, P<0.05表示差异显著, P<0.01表示差异极显著。试验结果采用平均值±标准误表示。

2.1 FRSM替代豆粕对生长猪生长性能的影响

由表3可知, 各组的ADFI、ADG和F/G均差异不显著 (P>0.05) , Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组的ADFI分别比Ⅱ组提高了6.11%、0.56%和2.22%, ADG分别比Ⅱ组提高了12.54%、5.54%和5.67%, F/G分别比Ⅱ组下降了8.54%、7.12%和6.05%。

3.1 FRSM替代豆粕对生长猪生长性能的影响

Tripathi等研究表明, 猪饲粮中添加含GS为1.3~2.8μmol/g的RSM影响采食量, 可能是因为GS引起的苦涩味降低了饲粮的适口性, 并且GS及其降解产物异硫氰酸酯、噁唑烷硫酮等会引起甲状腺功能的减退, 进而降低动物的生长性能。研究表明, 通过微生物固态发酵RSM饲喂动物, 能够改善动物生长性能。Ashayerizadeh等分别用50%和100%的RSM和FRSM替代豆粕饲喂肉仔鸡, FRSM组的体增重和饲料转化率相比于RSM组均显著提高, 死亡率显著降低。Chiang等在基础饲粮中添加10%FRSM饲喂肉鸡, 其ADG比添加10%RSM显著升高, ADFI和饲料转化率有所提高。本研究结果表明, Ⅲ、Ⅳ组的ADFI、ADG和F/G与对照组差异不显著, ADFI、ADG相比于Ⅱ组均有所提高, F/G有所下降, 与上述研究结果类似。这说明本研究通过微生物固态发酵RSM, 基本消除了抗营养因子的不良影响, 一定程度上改善了生长猪的生长性能, 并且提高RSM在生长猪饲粮中的添加量, 使FRSM用量提高为16%, 即RSM的用量为11.2%。

3.2 FRSM替代豆粕对生长猪血清生化指标的影响

血清生化指标能够综合反映动物机体的新陈代谢状况。血清中GLU含量是动物机体内能量平衡的重要指标, GLU含量的高低反映了消化吸收作用的增强或减弱。本研究结果表明, Ⅱ组血清中GLU的含量相比于其他各组均有所降低, 但各组差异不显著。胆固醇稳态是通过调节胆固醇摄取、胆固醇生物合成、胆固醇向胆汁酸的转化和胆汁酸的排泄来实现的。血清胆固醇含量是饮食中胆固醇 (外源性胆固醇) 和从头合成胆固醇 (内源性胆固醇) 的结果。本试验结果表明, Ⅲ、Ⅳ组血清中T-CHOL的含量较Ⅰ、Ⅱ组显著降低, 可能是因为本研究通过微生物发酵提高了肠道内益生菌的浓度, 益生菌定植在肠道发酵食物中难消化的碳水化合物, 产生短链脂肪酸, 其中丙酸会抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A (HMG-CoA) 还原酶的活性, 而HMG-CoA还原酶又是胆固醇合成的限速酶, 因而起到抑制肝脏胆固醇合成或使胆固醇在血浆和肝脏中再分配, 降低血清胆固醇含量的作用。另外, 本研究发酵所用短乳杆菌具有较高的胆盐水解酶活性, De Smet等用具有胆盐水解酶活性的短乳杆菌饲喂高胆固醇饮食的猪, 发现其血清中T-CHOL和低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C) 含量与对照组相比显著降低, 并且其粪便中总胆汁酸的排泄量也明显增加。这可能是因为胆盐水解酶能够降解胆酸盐, 使肠道内的胆盐被解离后, 溶解度降低, 不易被肠道回收, 促进体内胆汁酸向体外排泄, 机体为了弥补肝肠循环中胆汁酸的不足, 肝脏会利用血液中的胆固醇重新合成新的胆汁酸, 从而降低血清中胆固醇含量。Ⅲ、Ⅳ组血清中TP的含量比Ⅰ、Ⅱ组升高, UN含量下降, 可能是因为发酵RSM的益生菌可以利用蛋白质代谢过程中产生的非蛋白氮作为氮源合成菌体蛋白被动物吸收利用, 提高了氮的利用率, 并减少了粪氮的排放, 从而提高了TP的含量。而UN作为蛋白质、氨基酸代谢的终产物, 当氨基酸平衡良好时, UN含量下降 这与Hu等在基础饲粮中添加9.41%FRSM饲喂肉仔鸡, 其血清TP含量显著升高, 血清UN含量显著降低的结果一致。甲状腺激素是人和动物生长发育必不可少的内分泌激素。金邦荃等用高RSM饲粮饲喂猪, 其甲状腺明显肿大, 血清中T₄的含量相比于对照组显著升高, T₄/T₃异常。Mawson等用含高GS的RSM饲喂猪, 其甲状腺肿大, 血清T₃和T₄含量升高。本研究结果表明, Ⅱ组血清中T₄的含量相比于Ⅳ组显著升高, 血清T₃的含量相比于其他3组极显著升高, 与上述结果类似。这可能是因为RSM中抗营养因子GS的降解产物硫氰酸盐阴离子是碘的竞争者, 通过主动转运穿过细胞膜结合到甲状腺球蛋白的酪氨酸残基上, 阻碍甲状腺对碘的吸收, 干扰甲状腺球蛋白分解, 引起T₃和T₄分泌异常, 诱发缺碘性甲状腺功能亢进。Anke等以RSM为基础饲粮饲喂生长猪, 饲粮中补充碘 (1 mg/kg) 降低了硫氰酸盐阴离子对甲状腺的影响, 从而改善了生长猪的生长性能。本研究结果表明, Ⅲ、Ⅳ组血清中T₃和T₄含量与Ⅰ组差异不显著, 这与Xu等分别用33%、67%和100%的FRSM替代豆粕饲喂肉鸭, 其血清T₃和T₄的含量与对照组没有显著差异的报道一致, 说明通过微生物发酵有效降低异硫氰酸酯的含量, 缓解了甲状腺功能亢进。

3.3 FRSM替代豆粕对生长猪抗氧化能力的影响

机体的抗氧化酶体系 (如SOD、GSH-Px、T-AOC等) 可在不同水平上清除体内多余的自由基, 恢复机体正常的细胞代谢和功能。MDA是脂质过氧化作用的终产物, 测定血清中MDA含量能直接反映细胞膜被氧化的程度, 血清MDA含量显著升高意味着机体自由基增多, 细胞受损程度增强。Hu等在肉仔鸡试验上的结果表明, FRSM组相比于RSM组提高了血清T-AOC和SOD活性, 降低了MDA的含量, 这与本研究Ⅲ、Ⅳ组血清中SOD的活性高于Ⅰ、Ⅱ组, 且MDA的含量低于Ⅰ、Ⅱ组的结果一致。本研究通过微生物固态发酵RSM, 其水溶性蛋白和酸溶性蛋白含量相比于RSM分别提高了52.88%和44.40%, 而酸溶性蛋白主要由游离氨基酸和小肽组成。有研究表明, 通过固态发酵RSM会产生具有较强还原力的小肽, 这些小肽对羟基自由基 (·OH) 和二苯基苦基苯肼 (DPPH) 自由基清除能力较强, 而且小肽的分子质量越小, 其清除自由基的能力越强, 即抗氧化活性越强。

3.4 FRSM替代豆粕对生长猪免疫功能的影响

血液中的IgG、IgA和IgM含量的高低直接反映了动物机体全身的体液免疫状况。TNF-α是由内毒素激活的巨噬细胞和淋巴细胞等分泌的一种多活性的细胞因子, 是机体免疫防护的重要介质, 正常水平的TNF-α可以调节免疫应答、抗感染、促进组织修复、引起肿瘤细胞凋亡等。吴东等用FRSM等氮替代7.5%豆粕, 生长猪血清中IgA、IgG和白细胞介素 (IL) -2的含量显著升高, IgM、IL-1、IL-6和TNF-α含量无显著影响。王尚荣在基础饲粮中添加4%、6%和8%FRSM饲喂樱桃谷鸭, 45日龄时血清中IgG、IgA、IgM含量均比对照组略有提高, 但差异不显著, 60日龄时添加8%FRSM血清中IgG、IgA、IgM含量相比于对照组均显著升高。本研究结果表明, 各组血清中IgA、IgG、IgM的含量差异不显著, Ⅳ组血清中TNF-α的含量相比于Ⅲ组显著降低, 但与Ⅰ、Ⅱ组差异不显著, 说明Ⅳ组免疫功能没有受到负面影响。