复合酶与酵母菌协同发酵葡萄皮渣生产猪饲料
摘要：研究了以纤维素酶和木聚糖酶与酵母菌协同发酵葡萄皮渣生产猪饲料的方法。根据猪饲料的国家标准检测饲料中豆粕、麸皮、玉米面、葡萄皮渣等主要组分，利用正交试验确定了最佳配比：葡萄皮渣、豆粕、麸皮、玉米面质量比为2：2：1：2；酶的最适条件：纤维素酶3U／g，木聚糖酶5U／g，作用温度50℃，时间72h。产品的粗纤维质量分数为11.42(干基)，低于加酶前4.83。
葡萄酒工厂将葡萄压榨后会产生大量皮渣，通常有两种处理方法：一是作为粗饲料出售，不做加工，其营养价值比较低；二是作肥料倾倒或掩埋，但容易滋生病菌，污染环境。葡萄皮渣中含有较多的纤维物质，能快速通过猪的胃肠，导致养分的吸收利用率降低，因此会降低饲料利用效率。纤维素酶和木聚糖酶等组成的复合酶不但能降低粗纤维的含量，还能消除抗氧化因子，有效提高饲料的适口性和饲料的营养价值，对仔猪的生长也具有较大的促进作用。饲料中添加酵母菌已被广泛的应用，酶解后所产生的糖可用于酵母菌的生长，不仅可以提高饲料蛋白的品质，还能产生香味物质，促进猪的食欲增加葡萄皮渣在配合饲料中所占的比例能降低饲料的成本，增加效益；但是比例过大，也会降低营养物质的均衡以及饲喂的效果，所以选择合适的配合比例至关重要。本研究将葡萄皮渣与辅助农副产品豆粕、麸皮和玉米面等配合，经由复合酶降解和酵母发酵获得多量的细胞蛋白，依据猪饲料国家标准制成配合饲料。
材料与方法
1 材料
葡萄皮渣，辽宁某酒业有限公司；
豆粕、麸皮，大连某食品集团调味食品厂；
玉米面，市售；复合酶(纤维素酶和木聚糖酶等)，黑龙江肇东某有限公司；
酿酒酵母，广东某有限公司。
2 试验方法
2.1 葡萄皮渣饲料发酵工艺
原料→筛选→混合→加水→润料→灭菌→冷却→加酶→翻拌→降温→接种酵母→发酵→干燥→粉碎→成品。
2.2 操作要点
原料处理：剔除葡萄皮渣中的土块、石头等杂物。
原料混合：将原料葡萄皮渣、豆粕、麸皮和玉米面等按一定比例混合。
润料：原料与水按照质量比2：1充分润透，混合均匀，要求散而不凝，没有结团。
灭菌条件：121℃蒸汽灭菌60min。加入复合酶：将灭菌后的原料冷却至室温，于无菌室中加入复合酶。
加酶量分别为：纤维素酶2.0、2.5、3.0U／g；木聚糖酶5、6、7U／g。
酶解：在50℃下恒温72h，每日晃瓶2次，使发酵物松散、均匀。
接种活化酵母：活性干酵母按0.05%加入，使用前取适量无菌水，25℃活化2h。
酵母发酵：在30℃培养箱内发酵96h。
热风干燥：将发酵饲料摊于浅盘中，50℃热风风干12～24h。
3 检测方法
3.1 水分的测定
根据GB/T 6435—2006采用直接干燥法。
3.2 蛋白质的测定
采用微量凯式定氮法。
3.3 粗纤维的测定
根据GB/T 6434—2006采用过滤法。
3.4 灰分的测定
根据GB/T 6438—2007采用灼烧法。
3.5 还原糖得率
采用DNS法。测定水解液中还原糖质量分数：将试样放置在50℃的烘箱中12h，粉碎均匀后精确称取1.0000g，加入适量去离子水，50℃水浴30min，待溶液冷却后定容至100mI，再3000r／min离心5min，取上清液1mI进行DNS法检测，根据葡萄糖溶液标准曲线确定还原糖质量分数。
式中：m1为酶解后的还原糖的质量，g；m0。为初始还原糖的质量，g；m2为50℃烘干试样的质量，g；W为50℃烘干试样的含水率%。
3.6 总糖的测定
精确称取原料试样，经过酸水解、碱中和后定容，离心，采用DNS法测定。
3.7 酵母菌数的测定
称取10.00g发酵后饲料，加入50mI去离子水浸泡2min，上清液定容至250mL，采用血球计数板直接计数法测定。
结果与讨论
1 原料主要成分
葡萄皮渣由于加工的方式不同，其化学组分含量也会有所差别。根据猪饲料的国家(行业)标准，饲料配伍中必须兼顾碳水化合物、有机氮、粗纤维物质等主要成分的比例，以及在饲料中的质量分数。试验用的葡萄皮渣来自冰葡萄酒的压榨原料。测定的主要成分结果见表1。表中也给出了豆粕、玉米面以及麸皮等拟配合农副产品的检测结果。
由表1可见，葡萄皮渣中总氮含量较少，糖含量偏低，需采用其他农副产品补充其不足部分。玉米面含糖量较高，豆粕含氮量最高，麸皮的含氮量和含糖量适中，都是很好的营养源。
2 饲料配比
根据表1中原料的主要营养成分以及各种营养物质搭配的原则，在预试验的基础上设计成3种饲料配合比例，见表2。
配比的设计要考虑到尽可能多地利用葡萄皮渣，同时还要兼顾总氮等其他因素。由表2可知，虽然3个配比中粗纤维质量分数最小值是13.15，却仍然达不到国家(行业)标准粗纤维质量分数≤11.77(绝干)的要求，因此需要复合酶降解一部分粗纤维以达到标准。
3 葡萄皮渣配合饲料的干燥温度
制成的葡萄皮渣猪饲料需经过干燥，然后粉碎并取样检测。为了减少干燥时被检测组分的损失，同时保证取样均匀一致，采取风干方式。将发酵饲料在不同温度下热风干燥12h，检测其中还原糖的变化。试验从30～100℃，间隔10℃为一个梯度。结果见图1。
在30~50℃时，美拉德反应速度缓慢，饲料中还原糖损失比较少；超过50℃则糖的损失明显加快。所以本试验确定热风干燥条件为50℃、12h。此时水分已较低，可以方便地进行粉碎、取样。50℃热风干燥温度也比较容易控制，具有能耗少、时问短、营养成分保留完好的优点，适宜在生产中应用。
4 复合酶酶解工艺
影响复合酶水解的主要因素，包括底物配比、加酶量、作用温度和时间等。在葡萄皮渣配合饲料的3种配比中，粗纤维含量各不相同，因而酶解的底物量也不同。纤维素酶和木聚糖酶的比例直接影响复合酶的酶解效率。最佳工艺条件采取正交试验法确定，选择正交表L9(34)。根据表2和图1的结果，因素水平表如表3所示。
按照正交试验设计方案L9(34)进行饲料(配比)中的粗纤维降解试验，分别检测9组试验组合中的还原糖并计算得率，结果列于表4中。
将表4中极差分析结果最次要的因素B作为空列，进行方差分析，结果见表5。因素A影响较显著，因素C和D均为影响显著。因素作用的主次作用顺序是D>C>A，最优水平组合为A2C3D3复合酶的3种配比水平影响不大，因此考虑到复合酶的成本因素，因素B选择B1，则最优组合为A2B1C3D3，即酶解最优条件为：配比二——葡萄皮渣、豆粕、麸皮、玉米面质量比为2：2：1：2，纤维素酶加入3U／g原料，木聚糖酶加入5U／g原料，酶解温度为0℃，时间72h。
由于最优工艺条件组合没有含在表4的9组试验中，需要进行验证试验，结果还原糖得率为4.70％，高于表4中最好的A1B3C3D3组合的结果。
5 发酵过程中还原糖含量的变化
通过酵母菌发酵可以进一步软化饲料，同时产生酒香和酯香气味，提高饲料的适口性和营养价值。将3种饲料配比(表2)分别经过酶解以后，接种0.05活性干酵母，从72h开始发酵至168h，共计4d，发酵温度为30℃。降糖曲线见图2。
6 发酵过程中酵母数量的变化
酵母菌发酵从72h开始。3种饲料配比中酵母菌生长过程曲线见图3。
由图3可见，3组配比中的酵母数量在72～96h增长很快，而后逐渐缓慢。组二和组三的酵母生长比较旺盛，至168h时达到1.6×106个细胞，是发酵前的8倍左右而组l中的酵母菌生长缓慢。发酵后期，由于还原糖被消耗，产物不断生成，酵母生长速率降低。
7 发酵前后饲料中主要成分含量的变化
葡萄皮渣、豆粕、麸皮和玉米面按一定的比例配合，经复合酶酶解和酵母菌发酵后，粗纤维含量明显降低，酒味和酯味比较突出。表6为发酵前后配合饲料中总氮和粗纤维含量的变化数据。将较优的第2组配比饲料制成后，经过50℃热风干燥24h后测定总氮和粗纤维含量，结果见表6所示。
由表6可见，配比二在发酵前后总氮含量变化不大，一部分饲料的蛋白质在酵母发酵过程中转变成菌体蛋白，提高了饲料蛋白的品质。发酵后粗纤维降低了4.83，低于饲料行业标准；消化能值根据化学成分和总能计算为13.53MJ／kg，略高于饲料行业标准。
结论
葡萄皮渣配合饲料最适配合比例：葡萄皮渣、豆粕、麸皮、玉米面质量比为 2：2：1：2。复合酶的最佳配比为：纤维素酶3U／g，木聚糖酶5U／g，作用温度为50℃，时间为72h。发酵后的饲料成品中总氮18.81，粗纤维11.42，消化能值13.53MJ／kg，均达到了国标(行业)妊娠猪饲料要求。
研究发现，葡萄皮渣含有少量的糖分，氮含量偏低。脱水可以提高氮的含量，但同时也会增加粗纤维的含量。将豆粕、麸皮、玉米面与葡萄皮渣配合可以弥补葡萄皮渣的不足，但是粗纤维含量稍高于饲料行业标准。以纤维素酶和木聚糖酶为主的复合酶可以降解饲料粗纤维。试验中，复合酶将葡萄皮渣占27.2的配比二中的粗纤维降低了4.83，使之符合饲料标准。同时，最优的酶解条件A2B1C3D3将还原糖得率提高至4.70，为酵母菌生长和发酵提供了良好条件。
发酵饲料经过50℃热风干燥后，主要营养成分和风味物质基本无损失，产品中有少量还原性糖，其中的酵母菌也是优良的蛋白质资源，蛋白质含量大为提高。干燥的葡萄皮渣饲料成品有酒香、酯香和原料香味，提高了饲料的适口性。
葡萄皮渣配合饲料较普通配合饲料节约了成本，增加了经济效益。饲料中还可加入乳酸菌，有助于营养物质的消化和吸收，提升饲料的品质。饲料中赖氨酸的含量和磷、钙的含量也是影响饲料品质的因素，有待于进一步研究。
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