微生态制剂被认为是抗生素的潜在替代物之一，已被广泛关注。丁酸梭菌是从健康人和动物肠道分离出来的一种严格厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，具有产丁酸、产酶、叶酸等益生物质等特性。近年来，对丁酸梭菌的研究主要集中在生物医学和生物化工方面，在饲料工业上研究相对较少。相比于非芽孢杆菌，丁酸梭菌具有较强的抗逆性，并能促进动物生长、调节动物肠道微生态平衡、提高机体免疫力，在畜牧生产中具有广阔的应用前景。

本研究旨在筛选出对动物常见致病菌具有广谱抑菌活性的产抑菌蛋白的丁酸梭菌菌株，对其进行鉴定，并在体外研究其抗逆性和益生特性，为其在动物生产应用提供理论支撑。

1材料与设备

1.1材料与试剂

仔猪盲肠内容物10份，取自3个猪场；大肠杆菌K88(E.coli K88)、金黄色葡萄球菌ATCC25923(S.aureus ATCC25923)；梭菌增值培养基(RCM培养基)、梭菌选择性培养基(TSN培养基)、LB培养基，国产分析纯；细菌生化微量反应管、药敏纸片；细菌DNA提取试剂盒；猪胆盐，胰蛋白酶、蛋白酶K、过氧化氢酶，人工胃液、人工肠液根据中国药典进行配制；蛋白酶测定试剂盒、淀粉酶测定试剂盒、脂肪酶测定试剂盒。

1.2 实验方法

1.2.1 分离培养方法

采用厌氧培养箱来进行厌氧菌的液体培养、分离和稀释平板计数。取盲肠内容物10g加到90 mL PBS中，放人80℃水浴10 min以杀死非芽孢菌，放入RCM培养基，于37℃厌氧培养36 h；将样品分别稀释到10-3、10-5、10-7，涂布于TSN培养基，37℃厌氧培养48 h；采用影印平板法分离菌种，选取严格厌氧生长的菌株，进行镜检；根据丁酸梭菌的培养特性、菌落形态和显微形态等特征，挑选符合特性的菌株进行生理生化鉴定和16S rDNA序列分析。

1.2.2产抑菌蛋白的丁酸梭菌筛选

发酵上清菌液：分离的菌株在RCM液体培养基中厌氧培养24 h作为种子液；种子液按1％接种于新的RCM液体培养基中，37℃静置培养24 h作为发酵液。以8000 r/min，4℃离心10 min，取上清液备用。

指示菌的制备：LB培养基培养。种子液按1％接种于LB液体培养基中37℃，200 r/min摇床过夜，稀释到107CFU/mL备用。

抑菌试验初筛：采用孔穴琼脂扩散法。接种E.coliK88和S.aureus ATCC25923至LB培养基，培养过夜后转接1％至5 mL体积LB培养基中培养(200 r/min，37℃至OD600=0.6左右；灭菌后的250 mL LB固体培养基冷却至45～50℃时加入1‰的上述菌液，混匀后倒板；凝固后，用打孔器(孔径5 mm)在平板上打孔，分别加入50μL发酵上清菌液，阴性对照加入等体积的RCM培养基，3个重复/样，置于37℃培养24 h，测定抑菌圈直径。

抑菌试验复筛：发酵液和指示菌液体制备同上。检测各发酵液的pH值，对上清液进行排酸、过氧化氢酶和蛋白酶处理，孔穴琼脂扩散法测定其抑菌活性。

1.2.3丁酸梭菌的鉴定

形态学鉴定：将目标菌株涂板于RCM培养基平板，37℃培养24 h，观察菌落形态，挑取单菌落进行革兰氏染色镜检。

生理生化鉴定：运用细菌微量生化反应管对菌株进行生理生化特征分析。

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16SrDNA基因序列分析鉴定：细菌总DNA提取采用细菌基因组DNA抽提试剂盒提取。PcR引物序列：7F:5'-CAGAGTITGATCCTGGCT-3’、1540R:5'  AG-GAGGTGATCcAGcCGCA-3';反应体系(25μL):5xBuffer(with Mg2+)2.5μL;dNTP(各2.5mmol/L)1μL；7F(10 μmol/L)0.5μL；1540R(10μmol/L)0.5μL；基因组DNA(50 ng/μL)0.5 μL；TaKaRaExTaq酶(5U/μL)0.3μL；加双蒸水至25μL。PCR扩增程序：98℃预变性3 min，98℃变性25 s，55％退火25 s，72℃延伸1min，进行30循环，最后72℃延伸4 min。PCR产物利用1％琼脂糖凝胶电泳检测，片段为1500 bp左右的阳性产物经纯化后送上海生工序列测定。运用NCBI上的BLAST将测得的基因序列和GenBank数据库进行同源性比较；利用mega6.0构建丁酸梭菌系统发育树。

1.2.4丁酸梭菌的体外益生功能研究

1.2.4.1耐人工胃液和人工肠液研究

耐人工胃液能力研究取生长末期培养物离心(3000r/min，10 min)，PBS洗涤2次后重悬，以107/mL接种于人工胃液中，震荡混匀，37℃水浴孵育，每隔0.5 h取样进行活菌计数，3个重复/样；耐人工肠液能力研究将经过人工胃液处理后的菌体离心(3000 r/min，10 min)，PBS洗涤2次后重悬，以107/mL接种于人工肠液中，实验步骤同上。

1.2.4.2耐胆盐研究

耐胆盐能力研究在RCM液体培养基加入使其质量分数分别0.15％、0.20％、0.25％、0.30％、0.35％、0.40％的猪胆盐，121℃、15 min灭菌。菌种按1％接种，37℃静置培养，观察菌体生长变化。

1.2.4.3抗生素敏感性研究

抗生素敏感性用无菌玻棒将菌液(108/mL)均匀涂布在RCM平板上，摄取各种药敏纸片，分别紧贴于培养基表面，37℃厌氧培养24 h，测量抑菌圈的直径，根据标准进行判定，3个重复/样。

1.2.4.4产酶活性研究

蛋白酶活力测定采用福林酚法进行测定，采用蛋白酶测定试剂盒进行测定。淀粉酶活力测定：采用碘一淀粉比色法，采用淀粉酶测定试剂盒进行测定。脂肪酶活力测定：采用比浊法测定，采用脂肪酶测定试剂盒进行测定。

1.2.4.5产酸特性研究

挥发性脂肪酸测定采用顶空一气相色谱仪(Agilent6890)测定。菌液上清液用6％H3PO3，溶液按1：2(m/V)混悬后密封于顶空进样瓶中，直接进行HS-GC检测。顶空震荡室加热温度80℃、震荡加热时间28 min，进样针温度为100℃，分流进样，分流比3：1；采用DB-FFAP毛细管柱(30 mx0.25min x0.25μm)，进样口温度220℃，升温程序为初始温度80℃，以10℃/min升至230℃，保持2 min。恒流模式，载气流速为1.4 mL/min，FID检测器，检测器温度250℃。

1.3统计分析

采用SPSS Statistics18.0软件中的One-Way ANOVA进行方差分析，采用Duncan's法进行多种比较，结果均以平均值±标准差表示。

2结果

2.1丁酸梭菌分离与筛选

2.1.1丁酸梭菌的分离

从样品中分离出21株严格厌氧的革兰氏阳性细菌。根据细菌的菌落形态、细菌形态及严格厌氧特性能鉴定到属，经鉴定，12株菌株符合梭菌属细菌特性。根据梭菌属内的菌株进行芽孢位置染色实验和明胶液化实验可以鉴定到群，在群内只需进行蜜二糖、松三糖和淀粉利用实验，即可鉴定到种。分离到的12株梭菌进行芽孢染色实验、明胶液化实验和糖发酵实验。结果如表1所示，根据结果判定菌株ZJU-F1、ZJU-F2、ZJU-K3、ZJU-Y2、ZJU-Y3、ZJU-Z2为丁酸梭菌。

2.1.2产抑菌蛋白的丁酸梭菌筛选

对筛选到的6株丁酸梭菌，使用孔穴琼脂扩散法进行发酵上清液的抑菌活性实验。发酵上清液经过酸排、H2O2酶、和蛋白酶(胰蛋白酶、蛋白酶K)处理后与上清液原液相比，抑菌活性结果如图1、表2、表3所示。各菌株发酵液pH较低，酸排除处理后，ZJU-Y2、ZJU-Y3、ZJU-Z2菌株的发酵上清液抑菌活性消失，但pH4.5的乙酸、丁酸溶液对照并无抑菌活性。H2O2酶处理后抑菌活性并无显著差异，胰蛋白酶、蛋白酶K处理后抑菌活性则消失，说明起抑菌作用的物质是蛋白质。菌株ZJU-F1、ZJU-F2、ZJU-K3的发酵上清液对E.coliK88和S.aureus ATCC25923均具有抑菌活性。选择菌液抑菌活性最强的ZJU-F1菌株作为目标菌株进行下一步实验。

2.2丁酸梭菌ZJU—F1的鉴定

2.2.1形态学鉴定

丁酸梭菌ZJU-F1菌株在RCM固体平板培养12 h后，形态如图2-A所示，菌落呈奶油色圆形菌落，边缘整齐、不十分规则、稍突、表面湿润光滑，不透明，有酸臭味。挑取单菌落进行革兰氏染色，如图2-B所示，细菌直径为(0.6～1.2)x(3.0～7.0)μm，端圆，中间部分轻度膨胀，单个或成对，短链，偶见有丝状菌体，孢子卵圆、次端生，红色箭头为芽孢。

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2.2.2生理生化鉴定

丁酸梭菌ZJU-F1的生理生化试验和对不同碳源发酵利用情况试验结果如表4所示对照《伯杰氏细菌鉴定手册》检索，初步鉴定结果为丁酸梭菌。

2.2.316S rDNA序列同源性分析

以菌株丁酸梭菌ZJU-F1的DNA为模板，16S rDNA通用引物进行扩增后得到约1500 bp的特异性扩增产物。经同源性比对，菌株与C.butyricum的同源性达100％，属于梭菌属群1丁酸梭菌种，系统发育树见图3。

2.3体外益生功能研究

2.3.1耐人工胃液和人工肠液研究

丁酸梭菌ZJU-F1的人工胃液和人工肠液耐受结果如表5所示，pH=2的人工胃液对丁酸梭菌ZJU-F1的存活几乎没有影响。经人工胃液消化后，丁酸梭菌对人工肠液仍具有良好的耐受性，作用2.5 h后，细菌数目仍然没有显著变化。

2.3.2胆汁耐受性研究

不同消化道部位胆盐的质量分数不同，猪小肠中胆盐质量分数在0.03％~0.3％波动。由表6可以看出，ZJU-F1耐胆盐能力较强，在0.35％的胆盐培养能中仍能生长。

2.3.3抗生素敏感性研究

丁酸梭菌ZJU-F1对抗生素的敏感性和相容性如表7所示，青霉素类、头孢类和四环素类抗生素对丁酸梭菌ZJU-F1的抑菌作用较强，在饲料生产中不宜配伍；丁酸梭菌ZJU-F1对多肽类、氨基糖苷类和喹诺酮类抗生素耐受性较强，在动物生产中可以配伍。

2.3.4丁酸梭菌分泌消化酶活性实验

如表8所示，丁酸梭菌ZJU-F1能分泌淀粉酶和蛋白酶，不产生脂肪酶。当该菌株在动物肠道存活繁殖时，就可能分泌淀粉酶和蛋白酶来辅助消化，提高饲料的消化率和动物生长性能。

2.3.5丁酸梭菌分泌有机酸实验

丁酸梭菌ZJU-F1分泌的有机酸结果如表9所示，当丁酸梭菌在动物肠道存活繁殖时，丁酸梭菌能分泌丁酸、乙酸等有机酸到周围环境中，降低动物肠道pH值，同时丁酸是动物肠道上皮细胞的能量物质，能增强动物肠道屏障功能。

3讨论

3.1产抑菌蛋白的丁酸梭菌分离、筛选和鉴定

丁酸梭菌，根据其产芽孢的特性，对样品进行热处理以杀死非芽孢菌，涂布TSN培养基平板后初步得到纯菌株，再通过影印厌氧和好氧培养，得到严格厌氧菌。接着对所得到的菌株进行明胶液化实验、芽孢位置染色实验和糖醇发酵实验鉴定到丁酸梭菌种。

抑菌试验常用方法包括孔穴琼脂扩散法、牛津杯法、滤纸片法和浊度法等，琼脂扩散法具有操作便捷结果验证有效且更加直观等优点被广泛使用。菌液的抑菌活性则是通过其发酵过程中产生各种代谢产物包括酸性物质(有机酸)、过氧化氢酶和抑菌蛋白等来实现的。本试验采用孔穴琼脂扩散法对E.coli K88和S.aureus ATCC25923的抑菌效果表明，抑菌圈直径小于6 mm时抑菌活性较低，且发酵上清液对不同指示菌的抑菌效果并不相同。

为了得到产抑菌蛋白的丁酸梭菌，排除丁酸梭菌在发酵过程中代谢产物对结果的影响，本试验采用酸排除、H2O2排除等消除干扰因素。利用H2O2酶处理发酵上清后发现抑菌活性无明显影响，而调整pH至5.5后抑菌活性有所减弱，说明pH对抑菌活性有影响，而pH=4.5的乙酸、丁酸的培养基对照并无抑菌活性，说明抑菌活性并非由于酸性物质所致，但低pH环境可以增强其他抑菌物质的抑菌活性。发酵上清经胰蛋白酶、蛋白酶K处理后抑菌活性消失；说明发酵液中抑菌活性为蛋白质，可以初步确定其为细菌素，且该细菌素可被蛋白酶降解而不在体内残留，具有较高的安全性。

传统的菌落和细菌形态学、生理生化鉴定分析方法不能准确的鉴定出细菌的种属。16S rDNA序列是编码核糖体RNA小亚基16S rRNA的基因，具有高度保守的特性。16S rDNA技术则是通过对遗传特征的保守性序列分析，能够判断出细菌间亲缘关系的远近，从而准确的鉴定细菌的种属，该方法因其准确、快速、灵敏等优点已成为细菌鉴定有力手段之一。

本研究通过严格厌氧条件下产芽孢确定其为梭菌属细菌，并通过芽孢位置实验、明胶液化、糖发酵实验鉴定到种，最后通过16S rDNA序列分析技术鉴定。

3.2丁酸梭菌的体外益生功能研究益生菌制剂

作为饲料添加剂，需经过口腔、胃后进入肠道发挥益生功能，这就要求益生菌制剂能够耐受动物机体的防御机制。丁酸梭菌因具有产芽孢的特性，能够耐受各种消化酶、胃酸和胆汁的影响，具有较强的抗逆性，本试验筛选的丁酸梭菌ZJU-F1对人工胃液、人工肠液和胆汁具有较高耐受能力。

益生菌制剂的菌种选育标准要求筛选的菌株对常用抗生素具有较高敏感性，以证明菌株本身不含有耐药性质粒。而在实际动物生产中，饲料特别是幼龄饲料往往添加一定量的抗生素以防病和促生长，从而影响了益生菌的使用效果。因此，研究益生菌对各种药物的敏感性及配伍禁忌及其重要。本研究表明，丁酸梭菌ZJU-F1可和多肽类氨基酸苷类、喹喏酮类抗生素联合使用。

丁酸梭菌在动物肠道内产生对宿主的健康具有重要的生理意义的多种代谢产物，包括蛋白酶、淀粉酶、乙酸、丁酸等益生物质等。幼龄动物因其消化功能发育不全、消化酶分泌不足，导致生长性能受阻。丁酸梭菌能产蛋白酶和淀粉酶，在动物生产中应用可以提高动物的消化性能，从而提高饲料利用率。

挥发性脂肪酸(如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸)，对动物肠道健康起到重要作用。丁酸是动物肠道上皮细胞首选能源底物，具有促进动物生长、改善小肠形态、促进小肠消化吸收并增强动物机体免疫等功能。丁酸梭菌ZJU-F1在动物机体内生长繁殖可分泌大量的消化酶、乙酸、丁酸，在提高动物消化功能的同时具有降低肠道pH，并发挥抑菌效应，增强动物免疫功能的效果。

4结论

本研究仔猪盲肠内容物中分离到6株丁酸梭菌，通过多重抑菌实验对菌株进行初筛和复筛，得到产高活性抑菌蛋白的丁酸梭菌ZJU-F1。对目标菌株进行形态学、生理生化和16S rDNA基因序列同源性分析，鉴定结果为丁酸梭菌。丁酸梭菌ZJU-F1具较强的抗逆性和益生功能，作为饲料益生菌制剂具有很大的应用潜力。