1.1 试验材料

1.1.1 试验样品

实验室保藏芽孢杆菌菌株，筛选自养殖场土壤、畜禽粪便等样品。

1.1.2 试验菌株

大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella）、痢疾杆菌（Shigella Castellani）由河北农业大学制药工程实验室提供。

1.1.3 培养基

NA培养基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂1.5%~2.0%，pH值7.2~7.4。NB培养基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L，pH值7.2~7.4。发酵培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、氯化钠8.5g/L、磷酸二氢钾1g/L、葡萄糖1g/L。LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，pH值7.2。

1.2 菌株初筛

活化大肠杆菌菌种，并制备发酵液。将大肠杆菌培养液按1%的比例加到NA培养基中，充分混匀倒板，制成大肠杆菌病原菌平板。将实验室4℃冰箱保藏的单菌落菌株，采用十字划线法接种到大肠杆菌平板上，37℃培养观察其对大肠杆菌的拮抗情况。

1.3 菌株复筛

在初筛获得的菌株中，为了排除是生长竞争所导致大肠杆菌没有生长，采取平板扩散法进行复筛，观察抑菌圈直径。参照1.2和1.3的方法，将复筛得到的菌株依次用于沙门氏菌和痢疾杆菌拮抗菌的筛选，综合对3株病原菌的抑菌能力优选出3株拮抗菌进行后续研究。

1.4 功能菌株的种属鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》对菌株进行形态学观察。通过16SrDNA序列分析进行分子学鉴定，通过测序结果进行同源性比较，建立系统发育树，初步确定种属地位。

1.5 功能菌株的性质研究

1.5.1 功能菌株在不同pH值下的生长情况

制备功能菌株种子液，以1%的接种量转接于pH值为3.5、4.5、5.5、6.5的100mL发酵培养基中。37℃、180r/min培养48h，测定发酵液在600nm下的吸光值。

1.5.2 功能菌株在不同温度下的生长情况

制备功能菌株种子液，以1%的接种量转接于100mL发酵培养基中，分别在27、37、47℃，180r/min培养48h，测定发酵液在600nm下的吸光值。

1.5.3 功能菌株在不同胆盐浓度下的生长情况

制备功能菌株种子液，以1%的接种量转接于胆盐浓度分别为0、0.15、0.30、0.60g/L的100mL发酵培养基中，37℃、180r/min培养48h，测定发酵液在600nm下的吸光值。

1.6 功能菌株产消化酶情况

1.6.1 菌株产蛋白酶情况

通过平板扩散法将菌株发酵液离心上清液加入添加了10%脱脂奶粉的LB平板中，37℃培养观察是否有水解圈。

1.6.2 菌株产淀粉酶情况

通过平板扩散法将菌株发酵液离心上清液加入添加了1%淀粉的LB平板中，37℃培养48h，加入碘液观察是否有水解圈。

1.6.3 菌株产纤维素酶情况

通过平板扩散法将菌株发酵液离心上清液加入刚果红平板中，37℃培养48h观察是否有水解圈。

1.6.4 菌株产脂肪酶情况

通过平板扩散法将菌株发酵液离心上清液加入添加了1%三丁酸甘油酯的平板中。37℃培养72h观察是否出现水解圈。

2结果与分析

AGP作为一种非营养型的饲料添加剂，在促进动物生长，提高动物生产性能方面起着积极的作用，但是长期使用抗生素，会使病菌的抗药性增强，从而造成不同程度的感染。近年来，细菌耐药性等问题日益突出，无毒、无公害的微生态饲料添加剂的研究和开发显得日益重要。随着人们对更安全、优质的畜禽产品的追求，无抗养殖成为大势所趋，发酵饲料将起着非常重要的作用。目前，用于发酵饲料的添加剂有酸化剂、益生菌、酶制剂等物质，其中益生菌具有促进动物肠道有益菌群的形成等优势，受到广泛好评。近几年，研究发现益生菌也可以直接添加到饲料中，操作简便、成本较低廉、不会破坏饲料中的营养成分，还能提高饲料报酬，确保畜牧业安全生产，同时提高了经济效益。芽孢杆菌所进行的生物转化法能够产生抑制大肠杆菌生长的益生作用，抑制有害病原菌的生长和增强抵抗疾病的能力，可以广泛应用于畜牧行业中。

本研究得到的3株益生芽孢杆菌可以拮抗3种肠道病原菌的生长，并且可以耐受胃酸和胆盐的环境，这样就可以保证菌株随着发酵饲料进入肠道后有定植的可能，进一步发挥抗病的功能。近年来，一些真菌、细菌的代谢产物被证实能够起到益生作用，但大部分不可以直接加入饲料中对牲畜直接投喂，其提取产物的过程较为复杂、成本高。动物饲料中添加各种酶有利于动物生产，因为酶可以帮助消化饲料，提升饲料报酬，故酶制剂在动物生产中应用广泛。利用饲用益生菌本身产酶特性制备微生态制剂，在动物消化也可起到重要作用。本研究得到的3株芽孢杆菌均可以产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶，具备益生菌的潜质。芽孢杆菌可以形成芽孢体，抗逆性强，有利于产品的生产工艺和贮藏，进而保证产品的质量。本研究得到的菌株可以在不同的温度生长，并且可以耐受较低的pH值环境，这样就能解决菌株的干燥不耐高温和仓储期短的问题。因此，本研究筛选到的芽孢杆菌可以很好地应用于发酵饲料中，能达到减抗、替抗的效果，尤其是菌株B-1d为枯草芽孢杆菌，在饲料添加剂的目录中，可直接用于畜禽行业。