3.4 正交试验

发酵工艺优化采用3因素3水平L9（33）正交试验，共设9个处理，每个处理3个重复，各参数水平根据单因素试验结果，选择接种量、酶添加量、料水比3个因素进行正交试验，随后筛选出优化组合。

3.5 检测方法

硫苷含量检测采用氯化钯分光光度法；硫苷分解产物异硫氰酸酯（ITC）和噁唑烷硫酮（OZT）含量检测参照国家标准GB 13087-91.GB 13089-91；单宁含量检测参照国家标准GB/T 15686-2008；植酸含量检测采用分光光度法；粗蛋白含量检测采用凯氏定氮法；菜籽肽含量检测：称取过80目筛的待测样品，加入等体积10％三氯乙酸（TCA），在160r/min下振荡30min，而后4000r/min离心15min，取上清液采用Folin一酚法测定蛋白质总量；菜粕蛋白分布采用SDS—PAGE凝胶电泳；还原糖含量检测采用DNS分光光度法；钙含量检测参照GB／T 13885—2003，磷含量检测参照GB/T 6437—2002。

4 数据统计分析

数据采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理和方差分析，多重比较采用LSD法，显著水平为P<0.05。

结果与分析

1 菌酶协同酵解菜粕方式的确定(见表2)

由表2可知，处理方式3，即菌酶同步发酵，在菜籽肽含量提高和硫苷降解方面，同时取得较好的效果，硫苷降解率达到68.10％，菜籽肽含量为140.78mg／g，比发酵前提高了3.21倍。而处理4，即菌酶分步发酵方式，虽然菜籽肽含量的提高效果明显，但硫苷降解效果较差。因此，选择菌酶同步添加的方式进行协同酵解后续的单因素试验。

2 菌酶协同酵解条件研究

2.1 接种量对菜籽肽含量的影响(见图1)

随着接种量的增加，菜籽肽含量呈现先增加、后下降的变化过程。当接种量为1.5％时，菜籽肽含量达156.4mg／g，接种量为2％时，菜籽肽含量达164.3mg／g，增加幅度不大，因此本试验选择适宜接种量为1.5％。

2.2 酶添加量对菜籽肽含量的影响(见图2）

图2表明，当中性蛋白酶添加量为100U／g时，菜籽肽含量达到161.2mg／g；当酶添加量为250U／g时，菜籽肽含量最高，达166.4mg／g，与添加100U／g相比，增加幅度不大，考虑到加酶成本，本试验确定酶的适宜添加量为100U／g。

2. 3 料水比对菜籽肽含量的影响(见图3）

结果表明，随着发酵体系中水分含量的增加，菜籽肽含量呈逐渐增加的趋势，但考虑到含水率增加时，会显著影响到硫苷的脱毒效果，而料水比在1：1、1：1.1和1：1.2时，对菜籽肽含量的影响不大，因此确定最适料水比为1：1。

2.4 菌酶协同酵解条件的正交试验

以菜籽肽含量为指标，选取接种量、酶添加量和料水比进行3因素3水平正交试验试验，因素水平编码表和设计实施方案见表3。试验结果及方差分析见表4和表5。

正交试验的结果显示，接种量、酶添加量和料水比3个因素中，酶添加量和接种量是影响小肽含量的显著因素。3个因素对小肽含量的影响，依次为酶添加量>接种量>料水比。根据正交试验结果确定的最佳发酵条件为：接种量为1.0％，酶添加量为150U／g，料水比为1：1.0。

3 菌酶协同酵解菜粕营养成分分析

根据正交试验得到的最佳条件，进行菌酶协同酵解菜籽粕，并对处理前后的菜籽粕进行了营养成分分析和蛋白凝胶电泳，结果见表6和图4。

讨论

菜籽粕中存在较多的抗营养因子，其中硫苷是最主要的抗营养因子，其含量较高。物理法和化学法脱毒存在耗能高、蛋白损失大、成本昂贵等缺陷限制了其使用，微生物发酵法脱毒因其在很多方面能克服物理和化学法的缺点而受到普遍的重视和应用。本试验中，采用微生物发酵协同酶解处理后，菜籽粕中硫苷的降解率达74.23％，与黄茜等利用筛选获得的枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌和酿酒酵母进行菜粕发酵，得到硫苷的降解率达到89.06％的结果一致。同时，试验还表明，通过发酵可提高菜籽粕中的粗蛋白含量。刘军等从土壤中分离出若干霉菌、酵母菌和细菌，对其中3支菌株混合发酵，结果菜粕的粗蛋白含量提高了23％；国外Adarsh Palvigl利用少孢根霉发酵菜籽饼粕也发现蛋白含量得到增加。试验证实了微生物发酵是改良菜籽粕的有效手段。

目前，对植物源蛋白及活性肽的研究日益成为食品、医药及饲料等领域的热点。本试验中小肽含量比发酵前提高了3.7倍，菜籽粕中还原糖、Ca、P含量分别比发酵前提高了57.68％、26.83％和11.57％。同时SDS—PAGE蛋白凝胶电泳结果也表明，菜粕经菌酶协同酵解后，蛋白组分中高于25kD的大分子蛋白得到了较充分的降解。据报道，用蛋白酶酶解制备菜籽肽，可得到分子量较小的小肽，且蛋白水解度较高。但作为饲料添加剂生产成本太高，同时酶解法对植物源蛋白中抗营养因子的去除效果并不理想。采用菌酶协同酵解法制备菜籽肽，枯草芽孢杆菌能分解其中的抗营养因子作为营养物质供自身的生长，从而达到脱毒的效果，同时外源蛋白酶与微生物发酵产生的酶，将大分子量的蛋白降解为小分子量的蛋白肽，可有效提高菜粕的品质及蛋白利用率，为菜籽粕的深入开发提供新的途径。

结论

本试验对菌酶协同酵解生产高品质菜粕的发酵工艺进行了研究，通过单因素及正交试验，确定了采用枯草芽孢杆菌与中性蛋白酶同步发酵的方式，当接种量为1.0％，酶添加量为150U／g，料水比为1：1.0，发酵温度为35℃，发酵时问为48h时，菜籽粕中硫代葡萄糖苷(硫苷)的降解率达74.23％，其分解产物异硫氰酸酯(ITC)和嗯唑烷硫酮(OZT)的含量分别比发酵前降低了79.07％和55.56％；发酵后菜粕中单宁和植酸含量分别降低了31.17％和16.39％；发酵后菜籽粕中粗蛋白含量达41.30％，比发酵前提高1.92％，菜籽肽含量达170.12mg/g，比发酵前提高了3.7倍，还原糖含量比发酵前提高了57.68％，钙、磷含量分别比发酵前提高了26.83％和11.57％。同时，SDS—PAGE电泳结果表明，菌酶协同酵解工艺处理后，菜籽蛋白中大分子量亚基均得到较好的降解效果。

实战操作技术——棉菜籽饼脱毒变身优质饲料替代豆粕操作新技术

当前豆粕价格很高有些地方货源紧缺，而棉菜籽饼（棉籽粕、菜籽粕）价格相对便宜，棉菜籽饼是棉子、油菜籽榨油后剩下的饼状残渣，蛋白质含量较高，含有各种氨基酸成分。但由于棉菜籽饼中含有植酸、芥子碱等物质，这些物质含有一定的毒性，还会影响动物的消化吸收，不能大量使用，因此不建议直接饲喂给动物！

现在通过微生物饲料发酵剂的除毒脱毒技术，可以成功将菜籽饼变为优质添加饲料，直接按照1公斤发酵的棉菜籽饼（发酵前的重量）代替约0.85公斤豆粕进行使用。饲料发酵剂中的有益微生物，在发酵过程中分泌的代谢产物，可将棉菜籽饼中的毒性物质等有效分解。

豆粕、菜粕、棉粕成分对比

1.豆粕是一种高蛋白原料，无需脱毒即可用作饲料。其中蛋白质含量为40%-48%，赖氨酸含量为2.5%-3.0%，色氨酸含量为0.6%-0.7%，蛋氨酸含量为0.5%-0.7%。2020年11月12日报价每吨在3500元左右。

2.菜粕的粗蛋白含量在34%-38%之间，特点是蛋氨酸含量高（仅次于芝麻饼、粕），赖氨酸含量亦高。而精氨酸含量低，是饼、粕饲料中含量最低的。菜籽粕的有效能值偏低（淀粉含量低、菜籽壳难以消化利用）。矿物质中，钙和磷的含量均高，硒和锰的含量亦高。特别是硒的含量是常用植物饲料中最高的。2020年11月12日报价每吨在2900元左右。

3.棉粕蛋白质含量一般为44.32%，仅次于豆粕的蛋白质含量48%，而高于菜籽粕的蛋白质含量36.04%。精氨酸含量高达3.6%-3.8%，而赖氨酸含量仅有1.3%-l.5%，只有豆粕的一半。2020年11月12日报价每吨在3000元左右。

是否需要脱毒处理

1.豆粕无需经过脱毒即可用作饲料。而且豆粕中富含蛋白质和多种氨基酸，在不需要额外加入动物性蛋白的情况下，仅豆粕中含有的蛋白质和氨基酸足以平衡家禽和猪的食谱，促进它们的营养吸收。只有当其他粕类单位蛋白成本远低于豆粕时，豆粕才有可能被替代。

2.菜粕菜籽中含有硫葡萄糖苷、芥酸、单宁、皂角苷等不良成分，其中主要是硫葡萄糖苷。硫葡萄糖苷本身无毒，但在一定温度和水分条件下，经过菜籽本身含有的芥子酶的酶解作用而产生异硫氰酸酯、唑烷硫酮和腈类等有害物质。这些物质可引起甲状腺肿大，从而造成动物生长速度下降，繁殖力减退。单宁则妨碍蛋白质的消化，降低适口性。而芥酸阻挠脂肪代谢，造成心脏脂肪蓄积及生长受到抑制。。使用前需进行一定的脱毒处理，并且使用时要加以限制，具体喂量应根据菜粕中有害成分含量而定。经过脱毒处理的菜籽粕喂量可以加大，而“双低”油菜籽生产的菜粕喂量要受限制。同时，应结合菜粕的氨基酸组成特点，适当搭配其它饼粕。

3.棉籽中含有对动物有害的棉酚及环丙烯脂肪酸，尤其是棉酚的危害很大。在制油过程中，由于蒸炒，压榨等热作用，大部分棉酚与蛋白质、氨基酸结合而变成结合棉酚，结合棉酚在动物消化道内不被动物吸收，故毒性很小。另一部分棉酚则以游离形式存在于饼、粕及油品中，这部分游离棉酚对动物毒性较大，尤其单胃动物过量摄取或摄取时间较长，可导致生长迟缓、繁殖性能及生产性能下降，甚至导致死亡。幼小动物对棉酚的耐受能力更低。由于棉籽饼、粕中游离棉酚对动物有害，因此，在使用棉饼、粕时，要根据饲喂对象及饼粕中游离棉酚的含量加以限量。反刍家畜在有优质粗料及多汁青料的情况下，棉籽饼、粕的用量不受限制，不会造成中毒。对单胃动物要限制喂量，最好使用经过脱毒处理的棉籽饼粕。同时，使用棉籽饼、粕配制饲粮要注意氨基酸平衡，尤其是棉籽饼、粕的赖氨酸含量低，且利用率差，应注意添加赖氨酸。

发酵操作技术

发酵棉菜籽饼其实也是一个脱毒技术，具体操作如下：

1.仔细检查棉菜籽饼，剔除棉菜籽饼中严重变质发霉的部分，轻度发霉的原料可以忽略，因为微生物发酵能够脱霉。

2.将棉菜籽饼粉碎并添加适量的玉米粉淀粉类的能量饲料等，调节饲料营养比例。

3.每吨棉菜籽饼加入2公斤食盐、玉米粉（其它淀粉、面粉次粉等也可以，或者粉碎的生红薯300公斤也可以）100公斤、“99多功能饲料发酵剂”1包（500g/包，市场售价约25元，以高浓度乳酸菌、酵母菌、复合酶制剂的专业发酵剂）。

4.在混合物料中添加适量水分，使混合物料含水量保持在55%左右，以“手抓一把并紧握，无水滴落，松手后轻触即散”为宜，一般上述配方中需要加入清水约500-600公斤。

5.发酵方式根据实际环境条件各异，在桶、缸、塑料袋等容器中发酵均可。

6.发酵时要尽可能排尽空气进行密封发酵。如果使用的发酵容器有密封不严实的隐患，要在一开始就在其外层包裹一层塑料袋并扎紧。发酵过程中不能启封。

7.发酵时间受环境温度影响，通常夏季发酵2-3天，冬季发酵5-7天即可完成。发酵完成后，有较为强烈的酸香味，ph值在3-4。

规模运用混合发酵现场

塑料缸、饲料袋（有内膜）均可做发酵饲料

采用池子发酵

发酵完成的棉菜粕饲喂动物技术

需要注意的是，发酵后的饲料酸度较低，不可以取代禽畜全部日粮。其他类发酵饲料同理。饲喂时根据不同情况，将发酵饲料按照一定比例添加到日粮中，发酵完成的棉菜粕为湿料，具体使用量每大概1.5-2公斤发酵棉菜粕（湿料）代替动物日粮配方中1公斤豆粕的使用量进行代替使用，与其它饲料混合后直接饲喂，由于棉菜籽粕蛋白较高，最高使用量不要超过禽畜日粮饲喂量的40%（湿料重量）。如果发现发酵饲料过酸适口性变差，可在饲喂前在阳光下晒1-2小时，或添加适量的碳酸氢钠（小苏打）即可改善。

发酵过程中与发酵后使用过程中，发酵的容器要一直保持密封状态，可以长时间保存（一年左右）。

当前养殖业成本高居不下，而饲料成本是其中最高的，利用廉价原料发酵饲料（包括一些轻度发霉的粕类低价收回）是极佳解决办法。通过微生物饲料发酵剂的发酵作用，可以将轻度霉变饲料变成优质饲料，将不易消化的物质分解为可被畜禽吸收的小分子糖类、氨基酸等。同时发酵饲料中富含有益微生物、酶制剂、酸化剂等，可调节畜禽肠胃微生态环境并进一步提高饲料利用率。发酵饲料气味清香，提高了饲料的适口性，加上发酵饲料中有大约4℃的酒度，能够促进动物新陈代谢促进健康抵御疾病，是当前养殖业发展中重要的一环。

本技术也可以同样发酵菜籽粕（饼）、棕榈粕等，方法同上。

【视频】部分发酵饲料养猪鸡鸭带给你无臭味健康无抗养殖效果

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