1.1 发酵饲料的制备与防霉试验

采用南京农业大学动物科技学院消化道微生物实验室保存的唾液乳杆菌制备菌液，以8%的添加量将菌液与无抗乳猪配合饲料充分混合均匀，将混合均匀的物料放于密封袋中，排出空气后封装，置于37 ℃环境下发酵48 h，即得乳酸菌发酵饲料。

参照相关试验报道，本试验首先在发酵饲料中分别加入2. 50%丙酸钙( 分析纯，阿拉丁试剂有限公司) 、4. 0%柠檬酸( 分析纯，上海西陇化工有限公司) 、0. 30%双乙酸钠( 分析纯，阿拉丁试剂有限公司) 和0. 25%山梨酸钾( 分析纯，阿拉丁试剂有限公司) ，将上述防霉剂与发酵饲料混匀后，分别取出200 g 置于普通培养皿中，每组4 个重复，将培养皿置于温度28 ℃、相对湿度为72%的恒温箱中，分别在第1、2、4、6、8、10、15 和30 天取样分析; 结果发现，丙酸钙和双乙酸钠的防霉效果最佳。在此基础上，将0. 10%、0. 20%、0. 30%和0. 50%的双乙酸钠以及1. 50%、2. 00%、2. 50%和3. 00%的丙酸钙加入到发酵饲料中，形成不同梯度的添加量，分别取出200 g 置于非密封条件下，每组4 个平行，置于同样条件下观察，对照组不添加任何防霉剂。结果发现，添加2. 00%的丙酸钙组和0. 30%的双乙酸钠组的防霉效果最佳，基于此结果，采集饲料样品用于pH、乳酸、乳酸菌和霉菌指标的测定。

1.2 测定指标

1.2.1 饲料外观

分别在试验开始后第1、2、4、6、8、10、15、30 天观察饲料的霉变情况，主要包括气味、结块情况、霉变情况以及是否生虫等，并做记录。

1.2.2 饲料pH 值

用固体pH 计( HI9124N，哈纳沃德仪器( 北京) 有限公司) 分别测定试验第0、1、2、4、6、8、10 天的三组( 对照组、2. 00%丙酸钙组和0. 30%的双乙酸钠组) 发酵饲料pH 值。

1.2.3 饲料中乳酸的含量

分别测定试验开始后，第0、1、2、4、6、8、10 天三组饲料中乳酸含量的变化。取0. 5 g 饲料样品，加入4. 5 mL 去离子水，震荡5 min，静置一段时间后，取上层清液备用待测。采用乳酸试剂盒( A019－ 2，南京建成生物工程研究所) 测定乳酸浓度。

1.2.4 饲料中乳酸菌和霉菌菌落计数

分别测定试验第0、1、2、4、6、8、10 天三组饲料中乳酸菌和霉菌含量的变化。将发酵饲料在无菌条件下取出1 g 到离心管中，加入等量的生理盐水，混匀后梯度稀释，取稀释液100 μL 分别在MRS 以及虎红平板( 奥博星，北京) 上涂板，每组4 个重复，乳酸菌在37 ℃恒温培养箱中培养48 h，霉菌在28 ℃培养箱中培养72 h。

1.3 统计分析

数据结果以平均值±标准误( means ± SEM) 的形式表示，数据经Microsoft Excel ( 2010) 初步处理后，利用SPSS 18. 0 进行单因子方差分析，选择LSD法进行多重比较，显著性P 值置于0.05。

2.1 饲料的外观变化

从表1 可见，不添加防霉剂的对照组中的发酵饲料色泽由正常颜色到变暗，气味由发酵饲料特有的酸香味到略有油哈味至霉味、浓霉味。对照组在第4 天即出现点状霉变和油哈味，而添加双乙酸钠、丙酸钙和山梨酸钾的三组的发酵饲料的外观均无异常，但柠檬酸组出现点状霉变，而气味无异常; 第6 天时，对照组出现中度霉变且霉味较明显，双乙酸钠组和丙酸钙组外观无异常，柠檬酸组出现点状霉变且有油哈味，山梨酸钾组出现点状霉变但气味无异常; 第8 天对照组重度霉变且霉味较浓，双乙酸钠组和丙酸钙组出现点状霉变，但气味无异常，柠檬酸组组和山梨酸钾组均出现不同程度的霉变，且霉味较明显; 试验结束时，所有组的饲料均出现重度霉变，霉味浓，对照组、双乙酸钠组和丙酸钙组饲料均有虫变。

研究表明，在原料中水分含量较高的情况下，双乙酸钠可进入霉菌细胞内，通过对酶活性的破坏而使霉菌死亡。该结果与闫革华等报道基本一致，其发现双乙酸钠对生鲜牛奶的防霉效果要优于其他防霉剂。丙酸钙已广泛用于饲料防霉剂，在本研究中所用的四种防霉剂中，其抑菌谱最广，对大部分真菌和少部分细菌都有很好的抑制作用。洪亦武等的研究表明，丙酸钙对酵母菌、黑曲霉菌、灰绿曲霉菌和烟曲霉均等十几种霉菌都有较好的抑制作用。山梨酸钾在水中溶解度较低，因而可能在发酵饲料中难以发挥更好的防霉作用; 柠檬酸发挥防霉抑菌作用主要是依靠降低环境pH 来实现，由于本试验所用发酵饲料的pH 较低，所以柠檬酸难以发挥其酸性防霉效应。试验结果表明， 添加量为0. 30% 的双乙酸钠和2. 00%的丙酸钙防霉效果最佳，其原因可能与几种防霉剂的作用机制不同有关。

本试验中，乳酸浓度在第0 至第1 天时有缓慢增长，这可能是由于发酵饲料中仍有部分乳酸菌产生少量乳酸。随着试验时间继续延长，乳酸菌的大量死亡，在第2 天时乳酸含量开始缓慢下降。在保存至第4 天时，双乙酸钠组乳酸含量显著高于丙酸钙组和对照组，暗示双乙酸钠组中的酸性物质减少量少于丙酸钙组和对照组，这可能与双乙酸钠的防霉机理有关。双乙酸钠主要依靠游离出的乙酸分子破坏细胞内的酶系统来抑制微生物的活性，游离的乙酸也可以有效降低饲料的pH，这与双乙酸钠组的pH 值一直低于其他两组吻合。在本试验中，固态发酵饲料的pH 在发酵结束后的第2 天开始缓慢升高，并在第10 天达到7 左右，这意味着发酵饲料中的乳酸和挥发性脂肪酸等酸性物质已经几乎消耗殆尽，这一结果与Wang等研究结果相一致。Missotten 等的研究表明，乳酸菌发酵液体饲料的pH 会在达到稳定之后缓慢上升，这是由于饲料中菌体的大量死亡裂解，释放了大量的菌体蛋白，并且饲料中的某些微生物开始利用有机酸和菌体蛋白产生大量含有碱基的代谢产物，这些物质会导致pH 的上升。

黄通旺研究表明，在普通饲料中添加0. 1%的双乙酸钠可有效抑制饲料中霉菌的生长，且作用时间可以持续40 天左右。在本试验中，双乙酸钠和丙酸钙均可以有效抑制霉菌至第4 天，至第6 天以后饲料中霉菌数量超出限量标准，而对照组的霉菌数量在第3 天就已经超出限量标准。与黄通旺研究结果不一致的原因可能是饲料性质不同、保存条件不同，发酵饲料由于水分含量高，并且在本试验中暴露于空气中，霉菌更容易大量生长; 而石传林等在用双乙酸钠作为青贮饲料防霉剂时发现，添加双乙酸钠的青贮玉米秸质地松软，颜色黄绿、腐烂少，霉菌计数结果显示比对照组显著降低，这与本试验结果相一致。

考虑到发酵饲料的主要活性功能物质包括乳酸菌等活菌制剂及微生物代谢产物，因此，本实验同时研究了防霉剂对发酵饲料中乳酸菌数量的影响，据Heres 等报道，在不经过特殊处理条件下，乳酸菌液态发酵饲料中乳酸菌的数量在发酵结束后5 d 内开始大量死亡; Hansen 等也发现，在液体发酵饲料中乳酸菌的对数生长期出现在12 ～ 24 h，在进入稳定期后24 h 菌体开始裂解并释放大量菌体蛋白。在本试验中，添加双乙酸钠和丙酸钙以及对照组的发酵饲料中乳酸菌数量总体都呈明显下降趋势，与前人的研究结果一致。而丙酸钙的抑菌作用相对较强，乳酸菌的繁殖在本试验的开始即受到抑制，从这一点来看，双乙酸钠的防霉效果要优于丙酸钙。试验同时发现，随着保存时间的延长，添加双乙酸钠和丙酸钙的两组发酵饲料中乳酸菌的数量明显高于对照组，可能是两种防霉剂抑制了霉菌的大量增殖，饲料中的营养物质依然可以被乳酸菌利用进而生长，而对照组中，乳酸菌数量呈明显下降趋势，说明霉菌在大量繁殖的过程中可能竞争性的抑制乳酸菌的生长。