导读

从20世纪中叶研究起始至今，短短60年时间，饲用酶制剂先后经历了从以助消化为目的第一代饲用酶制剂、以降解简单抗营养因子为目的第二代饲用酶制剂，向以降解复杂抗营养因子或毒物为目的第三代饲用酶制剂的跨越（冯定远，2012）。第一代饲料酶制剂，由于其主要目的是补充体内“消化酶”，一般也称为“外源性营养消化酶”，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、乳糖酶、肽酶等；第二代饲料酶制剂则以降解“单一组分抗营养因子或毒物”为目的，如木聚糖酶、β- 葡聚糖酶、纤维素酶、黄曲霉毒素脱毒酶类等，这类酶以非淀粉多糖酶为主，主要是水解酶类，而黄曲霉毒素脱毒酶是分解酶类；以降解“多组分抗营养因子”为目的的酶制剂，如α- 半乳糖苷酶、β- 甘露聚糖酶、果胶酶、壳聚糖酶、木质素过氧化物酶，我们可称之为“第三代饲料酶制剂”。

当前，饲料酶制剂的研究和技术发展迅速，在饲料中的应用也越来越广泛，但是目前饲料酶制剂开发和应用中仍然存在许多问题。酶制剂在畜禽日粮中的应用还有不少的争议，而且这些问题和争议将会很长时间存在。不少的饲料酶制剂产品达不到作为饲料添加剂的要求，产品设计的盲目性还比较普遍。但不可否认，酶制剂是最有发展前景的饲料添加剂之一，作为一类具有生物学活性的饲料添加剂产品，天然、绿色、安全、高效是其本身的特性，决定了其使用具有广阔的前景。饲料酶制剂比其他酶制剂更加复杂，问题更突出，其中对酶制剂的功能、特性、作用，特别是如何与动物的生理特性结合起来，如何使其价值的量化，如何营养化等等，将是饲料酶制剂急需解决的问题，也是将来研究的重点。

影响酶制剂在饲料中应用的因素很多，既有酶本身的因素、动物对象的因素，也有日粮构成及其加工的因素，还有综合的因素等。本文将针对理想饲料酶制剂的一些特性以及如何根据动物生理特点、饲料加工等因素改进酶制剂的特性进行论述，并提出一些改进思路和设计方案。

1酶制剂的生物不稳定性

酶的本质是蛋白质，它与所有其他的饲料蛋白质一样，对动物胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶和饲料加工处理非常敏感。饲料蛋白质是以氨基酸为单位而发挥作用的，所以无需维持构型，而饲料酶制剂如果不能够耐受动物胃内的酸性环境、不能够抵抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化、不能够耐受饲料加工过程中的高温高湿条件，则其构型就会发生改变甚至被破坏，以致发生不可逆转的变性，而失去活性不再发挥作用。

从自然界中筛选的不同微生物基因所表达的酶制剂，其生物敏感性也有比较大的差异。Pettersson 等（1997）研究证实，由高温霉菌（Thermomyces）、腐质霉（Humicola）和木霉（Trichoderma）分离到的木聚糖酶在热稳定性上也存在差异。由木霉分离到的木聚糖酶在75℃调质温度下明显失活；而由高温霉与腐质霉分离到的木聚糖酶在85℃调质温度下可保留80%以上的活性。其中由高温霉菌分离到的木聚糖酶，即使在95℃的调质温度下仍可保留70%以上的活性。

所以，作为饲料用酶制剂，一方面我们要筛选特性好、对底物降解能力强的酶制剂，同时还要筛选的酶制剂尽可能耐受胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶和饲料加工制粒时的高温、高湿条件。当然，我们除了从自然界中筛选具备这些抗逆特性的酶制剂基因外，随着生物技术的不断进步，我们还可以对一些特性好的酶制剂基因进行针对性的抗逆特性改造。比如，我们可以通过基因突变选育或基因工程改造的手段，使由木霉分离到的木聚糖酶对饲料制粒调质温度的耐受性从75℃提高到85℃，即在85℃调质温度下可保留90%以上的活性。同样，我们也可以通过基因突变选育或基因工程改造的手段，获得能够耐受胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶的饲料酶制剂。

里氏木霉

2酶制剂的种类和来源的多样性

目前，用于饲料酶制剂的种类和来源非常多，如何选择适用于各种复杂的饲料原料和饲料配方以及不同的动物品种和生理阶段的酶制剂，这也是饲料酶制剂行业面临的一个重大课题。

以最常用的木聚糖酶和植酸酶为例，木聚糖酶由细菌和真菌产生，此类微生物包括：需氧性微生物（aerobes）、厌氧性微生物（anaerobes）、嗜温微生物（mesophiles）、嗜热微生物（thermophiles）和极端微生物（extremophiles）。通常，木聚糖酶对多聚木聚糖的内部β-1,4键有活性，这种木聚糖酶称为内切木聚糖酶。根据其对不同多糖的活性，内切木聚糖酶又可分为特异性和非特异性木聚糖酶（Coughlan，1992、1993）。特异性内切木聚糖酶仅对木聚糖的β-1,4键有活性，而非特异性内切木聚糖酶可以水解以β-1,4键连接的木聚糖、混合木聚糖的β-1,4键及其它糖类β-1,4键连接的多糖。

很多种微生物能够产生对植酸具有水解作用的酶类，Dvorakova（1998）列出了29种已知的能够产生植酸酶活性的真菌、细菌、酵母。所列的这29种微生物中，21种产生的是细胞外植酸酶，如细丝状真菌——黑曲霉（Aspergillus niger）能产生一种高活性的细胞外植酸酶等（Volfova等，1994）。植酸酶可以被分成6-植酸酶和3-植酸酶。这种分类是根据植酸分子水解的起始位点而划分的， 6-植酸酶多来源于植物，而3-植酸酶是由霉菌（Aspergillussp.）产生的。

我们在选择饲料酶制剂的时候，就要根据饲料原料中的抗营养因子特性来选择相应种类和来源的酶制剂。另外，为了提高酶制剂的降解效率并适应复杂的饲料原料和配方，我们还可以选择多种来源的作用于同一底物的酶制剂进行组合，即目前已经在饲料酶制剂行业中使用的组合酶技术。比如我们可以选择高效降解玉米木聚糖的木聚糖酶和高效降解小麦木聚糖的木聚糖酶进行组合，用于目前常用的玉米-小麦日粮；选择酸性木聚糖酶和中性木聚糖酶进行组合，以扩大木聚糖酶的作用pH范围，适应动物胃中偏酸性的环境和肠道的中性环境。

3动物种类和生理阶段的差异性

目前，单胃动物日粮中使用酶制剂已迅速得到普及和推广，酶制剂在单胃动物体内的作用机制和作用模式也已经建立。酶制剂在反刍动物日粮中添加对其生产性能有改善作用，但是结果并不完全一致，瘤胃消化道的特点（如有很多微生物菌落，能产生很多内源性酶制剂） 使得外源酶制剂在反当动物体内的作用机制更加复杂（McAllister等，2001）。同样是单胃动物，猪和家禽也是有差别的，猪和家禽对日粮中添加外源性碳水化合物酶反应不同的原因可能由生理解剖结构不同引起的（Chesson，1993；Dierick等，1994、1996）。与家禽相比，影响猪对酶制剂潜在反应的主要因素有：胃肠道解剖结构、消化能力以及食糜的特征等（Partridge，2001）。不同种类和来源的酶制剂的最佳pH值不同，肉仔鸡嗉囊的存在，使得一些酶在进人pH值低的肌胃之前，首先在相对高的pH值环境（pH值约为6.0）中发挥活性。而对于猪来讲，在胃的pH值更低的环境中（pH值小于3），酶制剂会迅速与其底物接触，而潜在地影响到外源性酶的活性。另外，家禽的固态和液态食糜的平均保留时间比猪少（Moran，1982），所以这两种动物对外源性酶制剂的需要及相对重要性也有差异。

幼龄动物的消化生理明显与成年动物不同，酶制剂的作用差别更大。用外源酶对豆粕进行预处理，这对幼龄动物特别是对早期断奶仔猪似乎有重要意义（Hessing等，1996；Rooke等，1998），而用酶制剂预处理的大豆粕对生长育肥猪似乎不特别重要。

根据不同的动物种类和生理特点来选择饲料酶制剂尤为重要。比如，乳仔猪处于生长发育的初级阶段，体内各种内源酶的分泌机能还不够成熟，同时喂给乳仔猪的饲料中通常含有较高的动物源性蛋白质、脂肪等，而含有较少的高水平抗营养因子的植物性原料，故乳仔猪日粮中酶制剂的选择应以酸性蛋白酶、中性蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等为主，以补充内源酶分泌不足，而非淀粉多糖酶类应作为辅助酶制剂使用。反刍动物饲料酶制剂的作用部位主要在瘤胃，由于瘤胃内特殊的消化环境（pH6.5左右的偏中性环境，大量的微生物群系，多种内源酶的作用），外源酶制剂在瘤胃中作用受到很多因素的影响，造成了外源酶制剂在反刍动物中使用的效果不确定性。但以瘤胃真菌基因所表达的中性纤维素酶和以瘤胃产甲烷菌基因表达的中性木聚糖酶（湖南尤特尔生化有限公司奶牛专用复合酶）在产奶牛日粮中的应用，取得了显著的效果，奶牛的产奶性能和乳脂产量有明显的提升（任慧波等，2013；徐晓明等，2014）。

4谷物中天然抑制因子对酶制剂的抑制作用

Debyser等（1997）在研究用大麦芽和未发芽小麦酿造过程中阿拉伯木聚糖的增溶作用时，首次证明了小麦中含有蛋白类木聚糖酶抑制剂。近年来在一些谷物（如小麦、黑麦、硬粒小麦、大麦、水稻和玉米）中已发现三种不同类型的木聚糖酶抑制剂，分别为TAXI 型、XIP型和TLXI 型。这些谷物中存在的抑制木聚糖酶活性的蛋白质，降低了木聚糖酶在动物生产中的应用效果。

Gebruers等（2001）用Bacillus subtilis 木聚糖酶和Aspergillus niger木聚糖酶作为纯化过程中抑制活性测定的实验酶，从小麦中得到了两种具有不同抑制活性的TAXI 亚型：TAXI-I 和TAXI-II。其中，TAXI-I 为非糖基化的碱性单体蛋白，分子量大约为40 kDa； TAXI-II 为非糖基化的二聚体蛋白，两个亚单位分子量分别为30 kDa 和10 kDa。

XIP型木聚糖酶抑制剂 XIP-I 是一种糖基化的碱性单体蛋白，pI 约为8.8，分子量为29 kDa，拥有一个独特的N-末端序列(AGGKTGQVTVFWGRN)，该抑制剂的糖基化水平约为2%(w /w)，与近年来鉴定的有两个N-糖基化位点的 XIP-I 的X-射线衍射结构相吻合。通过阳离子交换层析(CEC)和疏水色谱(HIC)的方法首先从小麦中分离出 XIP 型抑制剂，并用黑曲霉木聚糖酶作为其纯化的实验酶（McLauchlan W R，Garcia-Conesa M T，Williamson G.等，1999）。从其他一些谷物，如黑麦、硬粒小麦、大麦及玉米中纯化得到的XIP-I，其分子特性及N-末端氨基酸序列与小麦XIP-I 高度相似，都是碱性单体蛋白。其中，黑麦和硬粒小麦 XIP 的pI 为8.0～8.5，大麦XIP 的 pI 为8.1～9.0，玉米 XIP 的 pI 为7.0～7.5 (Goesaert H，Gebruers K，Brijs K等，2011)。通过高分辨率的阳离子交换及等电聚焦，已经从不同谷物中检测到至少5种亚型的XIP-I（Gebruers K，Goesaert H，Brijs K 等，2002）。

Fierens等（2007）发现，谷物中除了 TAXI 型和 XIP 型木聚糖酶抑制剂之外，还存在第三种在结构上完全不同于前两种的木聚糖酶抑制剂———TLXI ( Thaumatinlike xylanase inhibitor)型。TLXI首先在小麦中被发现，与类甜蛋白( TLPs) 的同源相似性达60%以上，且具有类甜蛋白典型的特征。因此，TLXI 型抑制剂被划分到类甜蛋白家族，与该家族的 TLP3 同源性最高。

通常来说，同一种木聚糖酶抑制剂对不同来源的木聚糖酶抑制程度有所区别。TAXI 型抑制剂作用于 GH11 家族细菌和真菌来源的木聚糖酶，而对 GH10 家族真菌木聚糖酶则没有抑制作用（Gebruers K，Debyser W，Goesaert H 等，2001）。除棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus，GH10) 木聚糖酶及厌氧真菌(如 Neocallimastix，GH11)来源的木聚糖酶外， XIP 型抑制剂 XIP-I 对 GH10 和GH11 家族的真菌木聚糖酶有抑制作用，而对 GH10 和GH11 家族的细菌木聚糖酶没有抑制作用(Flman R，McLauchlan W R，Juge N 等，2002)。TLXI 能非竞争性抑制大部分 G/11 家族的木聚糖酶，但不抑制 GH10 和高等电点的GH11 木聚糖酶。例如: G/11 家族高等电点的长枝木霉木聚糖酶II( pI9.0)、枯草芽孢杆菌木聚糖酶对 TLXI 不敏感。实验证实野生 TLXI 和重组 TLXI 均为慢的紧束缚型抑制剂，而 TAXI 和 XIP则属于竞争型的抑制剂（Fierens E，Rombouts S，Gebruers K 等，2007）。

谷物中木聚糖酶抑制剂的存在大大降低了木聚糖酶的使用效果，不仅增加了动物生产中的饲料成本，而且造成严重的资源浪费与环境污染。随着分子生物技术的发展和对木聚糖酶抑制剂研究的逐渐深入，弄清木聚糖酶抑制剂与不同来源木聚糖酶的作用机理，并进一步筛选出对抑制剂敏感度较低(具有良好抗逆性)的木聚糖酶，不仅是推动畜牧生产、提高经济效益的有效途径，同时也是响应低碳减排、实现可持续发展的重要举措。相关的研究已经取得较大进展， 第一是筛选出对抑制剂敏感度较低的木聚糖酶的天然菌株；第二是对木聚糖酶分子进行人工改良，以降低木聚糖酶对抑制剂的敏感度，最终获得对抑制剂敏感度极低的木聚糖酶及其工程菌株。

5日粮营养水平与酶作用提供可利用营养的比较性

从理论上讲, 不管是直接提高营养成分消化率的酶制剂（如蛋白酶、淀粉酶等）,还是间接提高饲料营养消化利用的酶制剂（如木聚糖酶、葡聚糖酶等）,都不同程度提高了动物消化道总的有效营养供应量，这与没有添加酶制剂的情况不同。在实践应用中，如果按照原来的营养参数设计日粮配方，营养水平已经偏高的情况下，供给有效营养总量已经足够，再使用酶制剂的意义就不大，生产中也有可能显示不出效果。营养水平较高的玉米-豆粕型日粮中添加酶制剂没有明显效果（Charlton，1996），在 Borja vila（1999）的试验中，当日粮中的大豆粕含量增加到60%时，其代谢能和未加酶组相比无差异。该结果与 Leske 等（1993）的报道一致，这说明有必要调整饲养标准。在某些情况下，使用了酶制剂以后，动物的采食量反而下降（不少情况是提高采食量），一种解释是使用酶制剂提高了可利用（有效）营养的供应，特别是可消化能或代谢能，有时候动物能够根据营养水平（如代谢能水平）调节采食量，相应地动物将减少饲料的摄人量。

目前在饲料酶制剂的精确使用和加酶日粮的饲养标准方面，不少酶制剂生产厂商和科研机构都投入了大量的人力物力进行研究，也取得了不少创新性成果。其中，加酶日粮ENIV（有效营养改进值）系统的建立和应用，给酶制剂的精确使用指明了方向，但由于不同来源的酶制剂即使针对同一种原料的降解效果也存在很大差异，故不同酶制剂生产厂家显然无法建立统一的饲料原料或日粮配方的ENIV值数据库供客户使用。这就要求酶制剂生产厂家必须针对自己的酶制剂（单酶或复合酶）建立常用饲料原料的ENIV值数据库供客户制作日粮配方时参考，这对酶制剂生产厂家来讲确实是一项投资巨大、耗时耗力，但意义重大的工程。

6酶制剂在畜禽饲料中应用功能的多元性

酶制剂在饲料中的应用功能有许多方面，其中营养功能是最主要的。但是，某些酶制剂并不表现营养的功能，反映在一般的生产性能方面的效果可能不明显。传统上，人们讨论酶制剂在畜禽日粮中使用的效果时，一般是考虑动物的生产性能，特别是日增重和饲料报酬。酶制剂在畜禽饲料中应用大部分也是改善动物传统意义上的生产性能，但是部分酶制剂的功能并不表现在典型的生产性能提高，而有可能是其他性能，或者是广义上的生产性能，例如外观表现、健康状况、整齐度、成活率、同期出栏的比例等等，广义上的生产性能同样也影响饲养的效益。这些狭义上的生产性能（或者传统意义上的生产性能）以外的其他动物生产性能指标称为“非常规动物的生产性能指标”（冯定远等，2011）。由于酶制剂的复杂性及其功能的多元性，有些时候，应用“非常规动物生产性能指标”评定饲料酶制剂的作用效果更有意义。

随着畜牧养殖业的快速发展和饲养水平的不断提高，人们对饲用酶制剂的特性和功能的要求也越来越高，理想的饲用酶制剂将是未来饲料酶制剂发展的方向和追求的目标。我相信，随着生物技术的快速发展和酶制剂应用技术研究的不断深入，理想的饲用酶制剂离我们越来越近，也会源源不断地应用到我们的畜牧养殖和饲料生产中，为提高畜牧养殖的水平和饲料工业的效益发挥不可磨灭的作用。