导读

我国是一个农业大国, 作物秸秆作为农业重要的副产品, 资源总量已超过8亿吨。秸秆因其营养品质及适口性差, 消化率低, 饲用化率仅为26%左右。近年来, 利用发酵技术将秸秆纤维转化为动物易消化吸收的蛋白饲料已成为一个研究热点。目前存在的主要问题是菌种单一、酶系不全、发酵周期长、转化效率低。

本研究根据不同微生物的代谢特征和协同机理, 考察混合菌群发酵小麦秸秆合成菌体蛋白的菌种配比及其接种顺序等影响蛋白产率的关键因素, 以达到发酵过程中菌群间的协调、互补作用。

1实验与方法

1.1 实验材料1.1.1 菌种

米曲霉 (Aspergillus oryzae) 、热带假丝酵母 (Candida tropicalis) 由陕西省酶工程研究所提供;产朊假丝酵母菌 (Candida utilis) 、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 由陕西省微生物研究所提供。

1.1.2 原料

纤维素酶由陕西省科学院酶工程研究所提供, 酶活力单位为1.4×105U/g。小麦秸秆产于陕西省西安市临潼区, 含水量9.18%, 粉碎后待用。本文所用小麦秸秆质量均以绝干物料计量。

1.1.3 培养基

(1) 液体种子培养基

a.米曲霉培养基:蔗糖3%, NaNO30.3%, MgSO4·7H2O 0.05%, KCl 0.05%, FeSO4·4H2O0.001%, K2HPO40.1%。

b.酵母菌培养基:葡萄糖2%, 蛋白胨1%, 酵母膏0.5%。

c.枯草芽孢杆菌培养基:蛋白胨0.5%, 肉膏0.3%, NaCl 0.5%, pH自然。

(2) 发酵培养基

小麦秸秆100g, 无机盐溶液300mL (组成为:尿素1.2%, (NH4) 2SO41.5%, MgSO4·7H2O0.05%, KH2PO40.2%) 。

1.2 实验方法1.2.1 预处理方法

发酵培养基灭菌后, 采用纤维素酶进行发酵前预处理, 使秸秆中的纤维素降解为单糖或低聚糖, 为后期微生物合成单细胞蛋白提供碳源。最适的酶解条件为:加酶量40U/g, 反应温度40℃, 酶解时间10h, 总糖含量43.24%。

1.2.2 分析方法

粗蛋白含量测定采用微量凯氏定氮法, 纤维素酶活力测定采用3, 5-二硝基水杨酸法 (DNS显色法)。

1.2.3 工艺流程

新的发酵工艺流程如下:

2结果与讨论

2.1 菌种筛选

将各发酵菌种的种子液按表1中的组合方式及顺序 (组合1为对照组, 不添加任何菌种) 接入经纤维素酶水解后的固体培养基中, 各接种量均为5%, 30℃静置发酵24h。定时搅拌以保持发酵物料各部位均匀, 防止结块。结束后烘干, 测定粗蛋白含量。

五种组合对蛋白质含量的影响见图1。由图1可知, 组合5为最优的菌种组合, 因此选择米曲霉、产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌作为混合发酵的菌种。

2.2 接种顺序及时间对蛋白质产量的影响

米曲霉可产生纤维素酶, 发酵前期应作为先导菌进一步分解残留的粗纤维, 为后期微生物合成菌体蛋白提供充足的碳源。在生产蛋白质的菌株中, 酵母菌在营养丰富的环境中繁殖最旺盛, 一些代谢产物又是细菌的营养物质。因此我们将接种的时间顺序设计为:米曲霉→产朊假丝酵母→枯草芽孢杆菌。此外, 如何控制接入各菌种的时间, 以达到菌种之间的协调、互补作用, 也是影响粗蛋白产率的关键因素之一。

实验采用分段接种法, 先将米曲霉种子液接入发酵培养基中进行发酵, 考察不同时间段接入酵母菌及枯草芽孢杆菌对合成粗蛋白产量的影响, 各接种量均为5%。

2.2.1 产朊假丝酵母的接种时间对粗蛋白产量的影响

分别于米曲霉发酵过程中的不同时间段接入酵母菌种子液, 3h后再接入枯草芽孢杆菌种子液。于30℃静置发酵24h, 取样烘干, 测定粗蛋白含量。由图2可知, 12h左右接入酵母菌的粗蛋白产量最高, 为11.16%。

2.2.2 枯草芽孢杆菌的接种时间对粗蛋白产量的影响

接种米曲霉发酵12h后, 再接种产朊假丝酵母, 然后分别于不同时间接入枯草芽孢杆菌种子液, 继续发酵24h, 取样烘干, 测定粗蛋白含量。

由图3可知, 接种酵母菌8h后再接入枯草芽孢杆菌的粗蛋白产量最高, 为12.59%。

2.3 发酵培养基的优化

本着以粗代精、以废代好、降低成本的原则, 对发酵培养基进行优化。麸皮含有丰富的蛋白质、碳水化合物、维生素及微量元素, 可为微生物发酵提供天然的有机碳源、氮源和营养因子。实验考察了发酵培养基中秸秆与麸皮的不同配比对生物合成蛋白质的影响。由图4可知, 秸秆与麸皮的最适配比为3∶1, 粗蛋白产量为23.19%。

2.4 部分显著因素的正交试验

在对微生物发酵体系中各参数进行不同水平测定的基础上, 确定了影响菌体蛋白产量的主要因素是接种量、菌种比例、发酵温度、发酵时间、秸秆与麸皮配比。因此, 选择上述五项为主要因素, 采用L16 (45) 正交试验表进行5因素4水平的正交实验, 以考察上述因素之间的相互影响和各因素水平的变化, 结果如表2所示。

通过直观分析法, 从表3的极差分析可知, 在所选的因素水平范围内, 秸秆与麸皮的比例对发酵体系影响较大, 各因素影响的主次顺序为:E>B>D>A>C, 并确定了最佳条件组合为A2B2C1D4E3, 即接种量为10%, 接种比例为1∶2∶1, 发酵温度为28℃, 发酵时间48h, 秸秆与麸皮配比为4∶1。通过发酵, 物料中粗蛋白含量由起始时的5.47%提高到27.13%。

3最佳发酵条件下动力学模型的建立

微生物发酵反应过程非常复杂, 利用数学拟合模型构建发酵动力学模式, 具有简单、易于分析验证和实现计算自动化的特点。建模的目的是为了更深刻的了解微生物复杂的代谢本质, 从而寻求最适的操作条件, 实现发酵过程的最优化。

3.1 动力学模型的选择

描述菌体生长动力学最常用的是Monod方程和Logistic方程, 其中Monod方程假设菌体生长为均衡型非结构式生长, 细胞成分只需要用一个参数即菌体浓度表示;培养基中只有一种底物是生长限制性底物, 其它组分含量充分, 不影响微生物生长;将微生物生长视为简单反应, 并假设菌体得率为常数, 没有动态滞后。在秸秆发酵过程中, 采用的混合菌群包括霉菌、酵母菌和细菌, 由于不同菌株之间的相互作用、生长环境的改变、代谢产物的反馈抑制以及营养物质的扩散限制, 导致菌体生长迟缓等异常现象, 故不宜采用Monod方程来描述此过程。

Logistic方程是一个典型的S曲线, 能很好的反应混合菌群发酵小麦秸秆过程中菌体浓度的增加对自身生长的抑制作用, 具有广泛的适用性。由于菌体量和蛋白增加量存在某一统计学意义上的相互关联, 故可以用宏观的蛋白质含量变化来间接描述菌体的生长过程。

3.2 动力学方程的参数确定

动力学方程对于了解发酵机理、掌握整个发酵过程中混合菌群生长的动态变化、优化发酵工艺具有重要的指导意义。设X、X0、Xm、K分别为粗蛋白含量的增加量 (%) 、初始增量 (%) 、最大增加量 (%) 和比生长速率常数 (h) , 则:

应用Origin7.5软件中的非线性方程Slogistic3, 将表4中最适条件下发酵反应实验数据进行最优化拟合, 结果如图5所示。实验数据和拟合曲线基本吻合, 且最大粗蛋白增加量Xm=23.38%, 比生长速率常数K=0.15/h, b=46.81;最大误差分别为±0.45、±0.008 6和±8.9, 误差值均低于10%, 说明该方程能够近似描述混合菌群发酵秸秆合成蛋白质的菌体生长过程。令粗蛋白增加速度为

, 因此, 发酵过程中粗蛋白的增加量随着时间变化的数学模型为:

作粗蛋白量增加速度v和加速度dv/dt随时间t的变化曲线, 结果如图6和图7所示。

由图6和图7可知, 粗蛋白增长速度在26h左右达到最大, 即vmax=0.87%/h。在16h和35h左右dv/dt达到峰值, 即dv/dt=±0.05%/h2。由此可以认为, 在16h以前为发酵的延迟期, 35h以后为发酵的衰亡期, 这之间的时间段为发酵的对数增长期和稳定期。图中曲线反应了整个发酵过程中混合菌群生长的内部变化规律, 可作为控制发酵生产周期的重要依据。

根据微生物群体的生长规律, 稳定期细胞浓度达到极大值, 发酵产物在此阶段形成和积累。动力学分析表明, 正交实验所显示的最适发酵时间48h已是混合菌群的衰亡期, 发酵合成菌体蛋白的发酵时间应控制在稳定期末期即35h结束, 此时收获的发酵产品既保证了较高的蛋白含量, 而且有害代谢产物少, 粗蛋白含量为25%左右。

4结论

本实验设计的最适分段接种工艺为:首先接种米曲霉, 发酵12h后再接种产朊假丝酵母, 继续发酵8h再接种枯草芽孢杆菌。以麸皮作为天然的有机碳源和氮源可以大大降低生产成本。对发酵培养基优化后的组成为:小麦秸秆与麸皮配比为4∶1, 1.5% (NH4) 2SO4, 0.05%MgSO4·7H2O, 0.2%KH2PO4和1.2%的尿素, 料液比为1∶3。

正交实验表明, 影响发酵主要因素的主次顺序为:秸秆与麸皮配比>接种比例>发酵时间>接种量>发酵温度;发酵的最适条件为:总接种量为10%, 米曲霉、产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌的接种比例为1∶2∶1, 发酵温度为28℃, 发酵时间48h。发酵产物中粗蛋白含量达到27.13%。

动力学分析有助于了解整个发酵过程中混合菌群生长的内部变化规律, 可作为控制发酵生产周期的重要依据。本研究表明, 发酵的稳定期在26~35h之间。因此, 将最适发酵周期由48h优化为35h, 发酵产物的粗蛋白含量为25%左右。

本研究在前期利用纤维素酶降解小麦秸秆的基础上, 通过混合菌群的协同发酵作用, 有效转化秸秆粗纤维, 提高了菌体蛋白含量;对微生物生长动力学模型进行探讨, 确定了相关的动力学参数, 改进了发酵工艺条件, 具有发酵周期短、有害代谢产物少、减少能耗、生产成本低, 蛋白质含量高的特点, 对于将秸秆纤维转化为蛋白饲料的发酵工艺的优化提供了参考。