摘要：

本试验旨在通过体外发酵法研究棉籽酶解蛋白对奶牛瘤胃发酵及瘤胃微生物区系的影响。选用体况、泌乳天数相近的4头荷斯坦奶牛作为瘤胃液供体，采用单因子试验设计，将采集的瘤胃液均匀混合后随机分为4组，即对照组(C组)、低浓度组(E组)、中浓度组(F组)和高浓度组(G组)，分别添加0(对照)、0.3%、0.5%和0.7%棉籽酶解蛋白(干物质基拙)。培养2、4、6、8、12、24、48 h后测定瘤胃发酵参数和瘤胃微生物数量。

结果表明：1)与对照组相比，培养2~8 h，各组pH显著降低(P<0.05)，但均处于正常范围之内；在整个培养过程中，各组氨态氮(NH3-N)浓度显著降低，菌体蛋白(MCP)浓度显著升高(P<0.05)；C组和G组的总挥发性脂肪酸(TVFA)、乙酸、丙酸、丁酸浓度均显著高于E组和F组(P<0.05 )，而E组和F组的乙酸/丙酸显著低于C组和G组(P<0.05 )。

2)与对照组相比，各时间点F组白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌数量显著增加(P<0.05 )。在整个培养过程中，G组反刍兽新月形单胞菌数量显著低于其他组(P<0.05)，F组布氏普雷沃氏菌数量显著高于其他组(P<0.05 )。培养2~6h，F组反刍兽新月形单胞菌数量显著高于对照组(P<0.05 )。综上所述，棉籽酶解蛋白的添加可改善瘤胃发酵模式，显著提高瘤胃纤维分解菌数量。在本试验条件下，棉籽酶解蛋白的最适添加剂量为0.5%。

引言：

瘤胃微生物以及瘤胃内环境的稳态在反刍动物对饲粮营养物质的消化过程中起着重要作用。饲粮中的蛋白质进入奶牛瘤胃后，70%能够被微生物所消化，其余30%进入真胃和小肠等部位进行消化。大部分饲粮中蛋白质被瘤胃微生物转化为微生物蛋白，其品质较优质蛋白质差，使饲粮中优质蛋白质的利用率降低。在奶牛饲粮中添加非蛋白氮会为瘤胃微生物合成微生物蛋白提供氮源，从而能够提高过瘤胃蛋白含量，有利于优质蛋白质在小肠段被消化吸收，进而提高其利用率。但是，非蛋白氮的使用需要注意诸多问题，如需添加能量饲料、配合粗蛋白质使用和防止氨中毒等。因此，探寻安全、有效的新型饲料添加剂有利于奶牛对饲粮中优质蛋白质的吸收利用，提高饲料转化率，改善乳品质。

小肽(SP)通常是指由2~3个氨基酸组成的寡肽，具有转运速度快、耗能低和不易饱和等特点，比单一氨基酸更容易被机体组织吸收和利用。因为小肽可被反刍动物机体完全吸收，对反刍动物自身的蛋白质营养具有重要意义，所以，小肽在反刍动物生产中的应用逐渐增多。棉籽酶解蛋白是以优质的植物蛋白质为原料，经组合液态酶酶解工艺生产的小肽产品，该产品对奶牛瘤胃发酵有无影响还需进一步研究。因此，本试验主要通过体外批次培养法，旨在研究棉籽酶解蛋白对奶牛瘤胃发酵和微生物区系的影响，为该产品作为饲料添加剂在奶牛养殖中的进一步应用提供科学依据。

材料与方法：

1.试验材料

试验所用棉籽酶解蛋白是通过植物蛋白酶解得到的功能肽产品，总蛋白质含量在45%以上，其中小肽含量为28%(谷氨酸含量9.55%、天冬氨酸含量4.20%、精氨酸含量4.47%、赖氨酸含量2.86%、亮氨酸含量2.76%、甘氨酸含量2.27%和苯丙氨酸含量2.27% )，由成都某公司提供。

2、试验设计

    选取4头健康、体况和泌乳天数相近的荷斯坦奶牛作为瘤胃液供体，每天07:00和18:00饲喂和挤奶，饲粮精粗(干物质基础)比为50:50。体外发酵底物与供体奶牛饲粮水平相同，粉碎后过1mm筛。本试验采用单因素随机试验设计，将采集的瘤胃液混匀后分为4组，即对照组(C组)、低浓度组(E组)、中浓度组(F组)和高浓度组(G组)，并分别在其底物中添加0、0.3%、0.5%和0.7%的棉籽酶解蛋白(干物质基础)，每组每个时间点3个重复，体外发酵培养48h，分别在2、4、6、8、12、24和48 h进行样品采集，每次3个重复全部采集瘤胃上清液。

3.体外发酵培养与样品采集

    采用瓶口向上且盖有橡胶塞的250mL玻璃瓶作为人工瘤胃培养瓶。试验前，将精确称取的2g基础培养底物放入人工瘤胃培养瓶中，C组、E组、F组和G组分别加入0、6、10和14mg棉籽酶解蛋白。参照Menke等的体外培养方法，将过滤后的瘤胃液与配制好的缓冲液按照1:2的比例混匀于持续通入二氧化碳的三角瓶中，制成人工瘤胃培养液，三角瓶置于39℃水浴中。抽取200mL人工瘤胃培养液分装于预热至39℃并通有二氧化碳的培养瓶中，盖紧瓶塞，放入39℃水浴摇床上开始厌氧培养。将玻璃瓶的2/3浸于控温水浴摇床中，摇床频率为40 r/min。试验过程中，每30 min进行1次排气，培养时间48h。

    在体外发酵培养过程中，分别在2、4、6、8、12、24和48 h取出3瓶，停止发酵。取出的样品使用EL20型酸度计测定培养液pH后，分为3部分：一部分取5mL瘤胃液装在含有2mL25%偏磷酸的10mL离心管中，-20℃保存，用于测定瘤胃液挥发性脂肪酸(VFA)浓度；一部分放到10mL离心管中，-20℃保存，用于测定瘤胃液中氨态氮(NH3-N)和菌体蛋白(MCP)浓度；一部分装在50mL离心管中，-80℃保存，用于后期瘤胃微生物DNA的提取和测定。

结果:

1.棉籽酶解蛋白对体外瘤胃发酵液pH的影响

由表1可知，在整个培养过程中，瘤胃发酵液pH均处于正常水平之中。在体外培养的8h以内，各组的pH均显著低于对照组(P

2.棉籽酶解蛋白对体外瘤胃发酵液NH3-N浓度的影响

由表2可知，随着培养时间的增加，各组NH3-N浓度均呈现先下降后上升的趋势。当培养8h后，各试验组瘤胃发酵液中NH3-N浓度明显上升，24~48 h则趋于平缓。在培养2~12 h，各组瘤胃发酵液中NH3-N浓度均显著低于对照组(P<0.05 )；在培养24和48 h时，F组瘤胃发酵液中NH3-N浓度均显著高于其他3组(P<0.05 )。除在2 h，F组和G组之间差异不显著(P>0.05)外，其余各时间段各组之间NH3-N浓度均呈差异显著(P<0.05)。

3.棉籽酶解蛋白对体外瘤胃发酵液MCP浓度的影响

由表3可知，在整个培养过程中，各组瘤胃液中MCP浓度均呈先上升再下降，再上升，再下降的趋势；在培养2~8h，对照组MCP浓度呈上升状态，之后趋于平缓。在各时间点，与对照组相比，各试验组瘤胃发酵液中MCP浓度显著升高(P<0.05 )；除2、12和24h外，G组在各时间点瘤胃发酵液中MCP浓度显著高于其他组(P<0.05 )。

4.棉籽酶解蛋白对体外瘤胃发酵液VFA浓度的影响

由表4可知，在整个培养过程中，各试验组总挥发性脂肪酸(TVFA)、乙酸、丙酸、丁酸浓度和乙酸/丙酸均呈先急剧上升，后缓慢上升趋势。各试验组之间TVFA、乙酸、丙酸、丁酸浓度在各时间段内均呈差异显著(P<0.05)；其中，C组和G组的TVFA、乙酸、丙酸、丁酸浓度均在较高水平波动，显著高于E组和F组(P<0.05 )；各时间点的E组和F组乙酸/丙酸总体上显著低于对照组和G组(P<0.05)。

5.棉籽酶解蛋白对体外瘤胃发酵液普雷沃氏菌数量的影响

由表5可知，在整个培养过程中，布氏普雷沃氏菌数量呈平缓式下降，易北普雷沃氏菌数量呈波动式下降；F组布氏普雷沃氏菌数量显著高于其他3组(P<0.05)，E组布氏普雷沃氏菌数量显著低于对照组(P<0.05)；G组布氏普雷沃氏菌数量在2~12h培养过程中显著低于对照组(P<0.05)。在培养2h时，F组易北普雷沃氏菌数量显著高于其他3组(P<0.05 )，而E组易北普雷沃氏菌数量显著低于对照组和G组(P<0.05 )；在培养8h时，G组易北普雷沃氏菌数量显著低于其他3组(P<0.05 ) ；在培养24 h时，E组易北普雷沃氏菌数量显著低于其他3组(P<0.05 )；在培养48 h时，F组和G组易北普雷沃氏菌数量显著高于对照组和E组(P<0.05)。

6.棉籽酶解蛋白对体外瘤胃发酵液反刍兽新月形单胞菌数量的影响

由表6可知，在整个培养过程中，各试验组反刍兽新月形单胞菌数量的变化趋势相似，在培养2~4h呈下降趋势，在4~6h急剧上升，之后趋于平缓趋势。在培养2~6h，F组反刍兽新月形单胞菌数量显著高于其他3组(P<0.05)；各时间点G组反刍兽新月形单胞菌数量显著低于其他3组(P<0.05)。

7.棉籽酶解蛋白对体外瘤胃发酵液中瘤胃球菌数量的影响

由表7可知，在整个培养过程中，各试验组的黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌数量变化趋势大体相同；黄色瘤胃球菌数量呈先增加后降低趋势，白色瘤胃球菌数量呈平缓上升趋势。各个时间点F组的黄色瘤胃球菌数量和白色瘤胃球菌数量显著高于其他3组(P<0.05)。

结论：

①添加棉籽酶解蛋白能够在合理的范围内降低瘤胃液pH和NH3-N的浓度，增加MCP浓度，促进瘤胃发酵，但对VFA的产生有一定抑制作用。

②添加棉籽酶解蛋白能够增加 瘤胃球菌的数量，促进瘤胃微生物对纤维的降解能力。同时，棉籽酶解蛋白会减少瘤胃中普雷沃氏菌的数量，有可能会抑制瘤胃微生物对蛋白质的降解。通过瘤胃发酵参数和微生物数量综合比较各组结果，棉籽酶解蛋白的最适添加剂量为0.5%。

实战操作技术——棉菜籽饼脱毒变身优质饲料替代豆粕操作新技术

当前豆粕价格很高有些地方货源紧缺，而棉菜籽饼（棉籽粕、菜籽粕）价格相对便宜，棉菜籽饼是棉子、油菜籽榨油后剩下的饼状残渣，蛋白质含量较高，含有各种氨基酸成分。但由于棉菜籽饼中含有植酸、芥子碱等物质，这些物质含有一定的毒性，还会影响动物的消化吸收，不能大量使用，因此不建议直接饲喂给动物！

现在通过微生物饲料发酵剂的除毒脱毒技术，可以成功将菜籽饼变为优质添加饲料，直接按照1公斤发酵的棉菜籽饼（发酵前的重量）代替约0.85公斤豆粕进行使用。饲料发酵剂中的有益微生物，在发酵过程中分泌的代谢产物，可将棉菜籽饼中的毒性物质等有效分解。

豆粕、菜粕、棉粕成分对比

1.豆粕是一种高蛋白原料，无需脱毒即可用作饲料。其中蛋白质含量为40%-48%，赖氨酸含量为2.5%-3.0%，色氨酸含量为0.6%-0.7%，蛋氨酸含量为0.5%-0.7%。2020年11月12日报价每吨在3500元左右。

2.菜粕的粗蛋白含量在34%-38%之间，特点是蛋氨酸含量高（仅次于芝麻饼、粕），赖氨酸含量亦高。而精氨酸含量低，是饼、粕饲料中含量最低的。菜籽粕的有效能值偏低（淀粉含量低、菜籽壳难以消化利用）。矿物质中，钙和磷的含量均高，硒和锰的含量亦高。特别是硒的含量是常用植物饲料中最高的。2020年11月12日报价每吨在2900元左右。

3.棉粕蛋白质含量一般为44.32%，仅次于豆粕的蛋白质含量48%，而高于菜籽粕的蛋白质含量36.04%。精氨酸含量高达3.6%-3.8%，而赖氨酸含量仅有1.3%-l.5%，只有豆粕的一半。2020年11月12日报价每吨在3000元左右。

是否需要脱毒处理

1.豆粕无需经过脱毒即可用作饲料。而且豆粕中富含蛋白质和多种氨基酸，在不需要额外加入动物性蛋白的情况下，仅豆粕中含有的蛋白质和氨基酸足以平衡家禽和猪的食谱，促进它们的营养吸收。只有当其他粕类单位蛋白成本远低于豆粕时，豆粕才有可能被替代。

2.菜粕菜籽中含有硫葡萄糖苷、芥酸、单宁、皂角苷等不良成分，其中主要是硫葡萄糖苷。硫葡萄糖苷本身无毒，但在一定温度和水分条件下，经过菜籽本身含有的芥子酶的酶解作用而产生异硫氰酸酯、唑烷硫酮和腈类等有害物质。这些物质可引起甲状腺肿大，从而造成动物生长速度下降，繁殖力减退。单宁则妨碍蛋白质的消化，降低适口性。而芥酸阻挠脂肪代谢，造成心脏脂肪蓄积及生长受到抑制。。使用前需进行一定的脱毒处理，并且使用时要加以限制，具体喂量应根据菜粕中有害成分含量而定。经过脱毒处理的菜籽粕喂量可以加大，而“双低”油菜籽生产的菜粕喂量要受限制。同时，应结合菜粕的氨基酸组成特点，适当搭配其它饼粕。

3.棉籽中含有对动物有害的棉酚及环丙烯脂肪酸，尤其是棉酚的危害很大。在制油过程中，由于蒸炒，压榨等热作用，大部分棉酚与蛋白质、氨基酸结合而变成结合棉酚，结合棉酚在动物消化道内不被动物吸收，故毒性很小。另一部分棉酚则以游离形式存在于饼、粕及油品中，这部分游离棉酚对动物毒性较大，尤其单胃动物过量摄取或摄取时间较长，可导致生长迟缓、繁殖性能及生产性能下降，甚至导致死亡。幼小动物对棉酚的耐受能力更低。由于棉籽饼、粕中游离棉酚对动物有害，因此，在使用棉饼、粕时，要根据饲喂对象及饼粕中游离棉酚的含量加以限量。反刍家畜在有优质粗料及多汁青料的情况下，棉籽饼、粕的用量不受限制，不会造成中毒。对单胃动物要限制喂量，最好使用经过脱毒处理的棉籽饼粕。同时，使用棉籽饼、粕配制饲粮要注意氨基酸平衡，尤其是棉籽饼、粕的赖氨酸含量低，且利用率差，应注意添加赖氨酸。

发酵操作技术

发酵棉菜籽饼其实也是一个脱毒技术，具体操作如下：

1.仔细检查棉菜籽饼，剔除棉菜籽饼中严重变质发霉的部分，轻度发霉的原料可以忽略，因为微生物发酵能够脱霉。

2.将棉菜籽饼粉碎并添加适量的玉米粉淀粉类的能量饲料等，调节饲料营养比例。

3.每吨棉菜籽饼加入2公斤食盐、玉米粉（其它淀粉、面粉次粉等也可以，或者粉碎的生红薯300公斤也可以）100公斤、“99多功能饲料发酵剂”1包（500g/包，市场售价约25元，以高浓度乳酸菌、酵母菌、复合酶制剂的专业发酵剂）。

4.在混合物料中添加适量水分，使混合物料含水量保持在55%左右，以“手抓一把并紧握，无水滴落，松手后轻触即散”为宜，一般上述配方中需要加入清水约500-600公斤。

5.发酵方式根据实际环境条件各异，在桶、缸、塑料袋等容器中发酵均可。

6.发酵时要尽可能排尽空气进行密封发酵。如果使用的发酵容器有密封不严实的隐患，要在一开始就在其外层包裹一层塑料袋并扎紧。发酵过程中不能启封。

7.发酵时间受环境温度影响，通常夏季发酵2-3天，冬季发酵5-7天即可完成。发酵完成后，有较为强烈的酸香味，ph值在3-4。

规模运用混合发酵现场

塑料缸、饲料袋（有内膜）均可做发酵饲料

采用池子发酵

发酵完成的棉菜粕饲喂动物技术

需要注意的是，发酵后的饲料酸度较低，不可以取代禽畜全部日粮。其他类发酵饲料同理。饲喂时根据不同情况，将发酵饲料按照一定比例添加到日粮中，发酵完成的棉菜粕为湿料，具体使用量每大概1.5-2公斤发酵棉菜粕（湿料）代替动物日粮配方中1公斤豆粕的使用量进行代替使用，与其它饲料混合后直接饲喂，由于棉菜籽粕蛋白较高，最高使用量不要超过禽畜日粮饲喂量的40%（湿料重量）。如果发现发酵饲料过酸适口性变差，可在饲喂前在阳光下晒1-2小时，或添加适量的碳酸氢钠（小苏打）即可改善。 

发酵过程中与发酵后使用过程中，发酵的容器要一直保持密封状态，可以长时间保存（一年左右）。

当前养殖业成本高居不下，而饲料成本是其中最高的，利用廉价原料发酵饲料（包括一些轻度发霉的粕类低价收回）是极佳解决办法。通过微生物饲料发酵剂的发酵作用，可以将轻度霉变饲料变成优质饲料，将不易消化的物质分解为可被畜禽吸收的小分子糖类、氨基酸等。同时发酵饲料中富含有益微生物、酶制剂、酸化剂等，可调节畜禽肠胃微生态环境并进一步提高饲料利用率。发酵饲料气味清香，提高了饲料的适口性，加上发酵饲料中有大约4℃的酒度，能够促进动物新陈代谢促进健康抵御疾病，是当前养殖业发展中重要的一环。

本技术也可以同样发酵菜籽粕（饼）、棕榈粕等，方法同上。

相关链接：99多功能饲料发酵剂——高浓度乳酸菌为主的固态饲料发酵剂，更轻易成功、效果更好的生物饲料发酵剂，简单好用的中草药发酵剂

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