豆粕中抗营养因子及其消除方法_微生物试验报告与运用_微生物知识

豆粕中抗营养因子及其消除方法

2020-05-17 12:38:54 点击：

二十世纪九十年代以来，在英国疯牛病危机之后，引发了人们对畜禽饲料中动物来源蛋白质安全性的担忧，世界各国纷纷禁止动物源蛋白质在饲料中使用，由此相应地增加了对高质量植物蛋白的需求量。这意味着能够提供优质蛋白质的大豆和大豆蛋白制品必将在今后的畜禽饲料配制中扮演更加重要的角色。然而，大豆中含有的抗营养因子降低了养分的有效性，限制了其在动物饲料中的使用。因此，通过育种、加工和营养等手段来降低大豆及其制品中抗营养因子的含量，提高养分的利用率一直是营养学家们工作的重点。

豆粕是大豆经浸提或预压浸提制油工艺的副产物，为植物性蛋白质饲料的主要来源之一，占畜禽蛋白质饲料原料用量的百分之六十以上。大豆榨油过程中的热处理可以有效地灭活大豆中的胰蛋白酶抑制因子和大豆凝集素等抗营养因子，但生产中对热处理必须进行严格控制：加热不足不能完全灭活抗营养因子，而加热过度，有可能因发生美拉德反应而降低养分的可利用率，使得豆粕的营养特性发生很大的变化（Helena等，2003），与传统的豆粕相比，发酵豆粕在营养成分含量、氨基酸有效性和抗营养因子去除率等方面均有很大提高。

发酵豆粕是采用独特的菌种和发酵工艺，利用微生物发酵过程中分泌的蛋白酶使大豆蛋白被分解成小分子蛋白和小肽分子，游离氨基酸和UGF（未知生长因子）等物质，同时能消减抗营养因子的一些作用，使其易被幼龄动物消化吸收。因此，发酵豆粕作为功能性饲料蛋白质而受到广泛关注。大量的研究将发酵大豆蛋白和豆粕对于早期断奶仔猪的饲养效果进行比较（Cho等，2007），表明发酵过程中的酶解作用使发酵豆粕中含有较高比例的小肽（Hong等，2004）以及降低了发酵豆粕中的抗营养因子含量（Reddy和Pierson，1994）。但就目前来看，豆粕通过发酵工艺，微生物分泌蛋白酶降解蛋白的作用是否完全，抗营养因子被去除的程度，养分价值被提高的真实水平都有待探讨，所以进行动物饲养试验，并结合有效、全面的指标检测是必需的，关键是要采用简便、敏感度高的方法。

1 大豆的抗营养因子

目前，人们把对营养物质的消化、吸收和利用产生不利影响以及使人和动物产生不良生理反应的物质，统称为抗营养因子（antinutritional factors，ANFs）。人们很早就发现直接摄入豆科籽实会导致人和动物产生胰腺肿大、过敏反应、生长缓慢、日粮养分利用率下降以及一些不良生理反应的现象，这些生理反应是由大豆中含有的多种抗营养因子共同介导。从二十世纪初期，人们就开始了对大豆中抗营养因子的研究，并随着物理学、化学、免疫学、分子生物学等相关研究技术的发展逐步深入，成为动物营养研究的热点领域之一。多年来，人们对大豆中各种抗营养因子使动物产生的生理反应进行了大量研究，其效应会因抗营养因子的种类、含量以及动物的种类等的不同而有很大差异，见于表1.1。

表1.1 大豆中抗营养因子对动物的生理效应

根据对饲料营养价值和动物生物学反应，将大豆中抗营养因子分为以下六类：（1）降低蛋白质消化率和利用率的因子（蛋白酶抑制因子、糜蛋白酶抑制因子、凝集素等）；（2）降低碳水化合物消化率因子（酚类化合物如单宁和寡糖等）；（3）影响矿物质利用率的因子（植酸）；（4）影响维生素活性或增加动物维生素需求量的因子，包括抗维生素A、维生素D、维生素E和维生素B12等因子；（5）刺激免疫体系的因子（抗原蛋白）以及其它一些抗营养因子（致甲状腺肿因子、皂甙、异黄酮和生氰糖甙等）；（6）饲料中具有毒素作用的因子（凝集素）（李德发，2003)。

1.1 大豆蛋白酶抑制因子

大豆蛋白酶抑制因子是指能和蛋白酶的必需基团发生化学反应，从而抑制蛋白酶与底物结合，使蛋白酶的活力下降甚至丧失的一类物质。通常所说的蛋白酶抑制因子是指蛋白质类胰蛋白酶抑制因子（trypsininhibitors，TI），按其结构组成可分为库尼兹大豆胰蛋白酶抑制因子（Kunitztrypsininhibitor，KTI）和包曼-伯克蛋白酶抑制因子（Bowman-Birkproteinaseinhibitor，BBI）两类，生大豆中含有1.4%的KTI和0.6%的BBI（李德发，2003）。其中KTI主要对胰蛋白酶有特异性的抑制。因此，KTI含量的高低在很大程度上决定了大豆所具有的抗营养作用的强弱。另外，非蛋白质类蛋白酶抑制因子不具有特异性，易失活，所以生理功能常被忽略。

大豆蛋白酶抑制因子是大豆中的主要抗营养因子之一。采食含蛋白酶抑制因子的日粮后，畜禽的采食量、日增重和饲料转化率降低，但其影响程度受日粮中蛋白酶抑制因子浓度高低的影响。以雏鸡为例，当基础日粮中KTI的添加水平为2.37 g/kg时，其日增重比对照组下降26.2%；当KTI添加水平达8.64 g/kg时，生长速度下降56.2%（Han等，1991）。此外，对大豆蛋白酶抑制因子的耐受量与动物的种类、生理阶段（贺英等，1998；李素芬等，2000）、采用的饲喂方式以及饲喂时间等（李素芬等，2000）有关。

1.1.1 大豆蛋白酶抑制因子的测定研究

因为科学家们对动物对蛋白酶抑制因子耐受量的深入研究以及蛋白酶抑制因子失活方法的发展，所以我们十分迫切地希望有一种方便、精确的测定方法。但是，这方面的研究比较薄弱（王冬燕，2003）。

目前，实际生产中多以脲酶活性来判断大豆胰蛋白酶抑制因子的钝化程度，实验室采用的酶化学检测方法步骤繁琐、灵敏度低，而且测定加热过度产品时，结果变异较大，因此实际生产中很少采用。酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）也是一种胰蛋白酶抑制因子的测定方法。这种方法灵敏度高、特异性强、准确性好、省时，但过程较复杂繁琐，需要专用的仪器设备。王冬艳（2003）以ELISA检测方法为基础，组装了大豆胰蛋白酶抑制因子（KTI）单克隆抗体免疫检测试剂盒，检测范围为0.01~10 μg/mL。ELISA检测试剂盒的研制与推广应用，解决了酶联免疫吸附测定法部分操作繁琐的问题，使得一般条件的实验室和生产单位能够简便快捷地测定出大豆中胰蛋白酶抑制因子的含量，为大豆胰蛋白酶抑制因子（KTI）的研究以及饲料工业的质量检测提供前沿技术。

1.2 大豆凝集素

Liener和Pallansch（1952）采用等电点盐析、移动界面电泳、超速离心沉淀技术结合红细胞凝集反应检测生物活性方法，从大豆提取物中分离出一种能凝集红细胞的蛋白质，并将其命名为大豆凝集素。其特点是能与糖结合，是具有生物活性的糖蛋白，能凝固红血球，因为植物凝集素与动物细胞上的特异糖基有很高的亲和力，不同动物细胞表面有不同类型的糖基，所以不同来源植物凝集素与不同种动物的细胞膜有特异性结合反应（徐晓峰和朱才，1996）。大豆凝集素与兔红细胞有特异性凝血反应，并使细胞凝集从悬浮液中析出，可根据凝血反应强度，用凝血效价表示含量。

大豆凝集素的抗营养作用有：对动物生长有抑制作用，并随动物种类、生理阶段和饲喂量等而变化；影响营养物质的消化吸收，其中对氮代谢的影响比较明显，尿氮损失随着日粮凝集素水平的提高而明显增加；对小肠结构和功能有影响（李振田，2003）。

1.2.1 大豆凝集素的检测方法

人们运用凝集素具有和红细胞凝集的特性，采用体外试管内红细胞凝集反应对凝集素进行观察和量化。同一种饲料样品对不同种类动物的红细胞凝集活性不同。不过因为红细胞来源对测定结果有重要影响，于是有学者提出一种不需要红细胞的方案，就是用与相应凝集素具有结合特异性的糖复合物共价连接与聚苯乙烯胶粒替代红细胞，其余步骤不变，这种方法较为简便。对于大豆凝集素来说，把N-乙酰基-半乳糖胺和乳糖共价连接于胶粒上，是最灵敏的凝集反应系统（潘洪彬等，2005）。

1.3 大豆寡糖

大豆寡糖是大豆中含2~10个单糖基的低聚糖的总称，主要包括蔗糖、棉籽糖、水苏糖以及少量的毛蕊花糖。在自然界中，寡糖广泛存在于豆科植物中，但以大豆中的含量最高。大豆寡糖属于可溶性碳水化合物，一般占大豆固形物总量的7%~10%，其中蔗糖、棉籽糖和水苏糖各占5%、1%和4%，棉籽糖和水苏糖被视为难消化糖（李德发，2003）。

人和动物摄入适量的大豆寡糖是有益的，能够促进肠道有益菌的增殖；起到防治便秘的作用。但这个剂量范围很小，一般认为大豆制品中的寡糖对单胃动物不利，引起胀气和腹泻。Zhang等（2003）报道，在玉米-奶粉型日粮中添加1%和2%水苏糖可显著降低断奶仔猪的增重速度，饲料转化有下降的趋势。

1.3.1 大豆寡糖的测定

尽管有关寡糖的分析方法有报道，但传统的方法普遍存在分离效果差的问题。因此，张丽英等（2004）在实验室条件下建立了一个测定大豆及其产品中大豆寡糖（蔗糖、棉籽糖、水苏糖）气相色谱分析方法。本方法对测定大豆寡糖具有灵敏度高、简便和可靠及回收率高等特点，是研究大豆寡糖与动物营养素间关系的有效方法。周红等（2001）通过交联葡聚糖凝胶柱层析柱分离发酵液中寡糖，再用苯酚-硫酸法测定发酵液中的寡糖含量。分析测定结果可为发酵液的优化配制提供依据。

1.4 大豆抗原蛋白

大豆中的抗原蛋白主要包括大豆球蛋白（glycinin）和三种伴大豆球蛋白（α-conglycinin、β-conglycinin和γ-conglycinin）。其中glycinin和β-conglycinin是大豆中免疫原性最强的两种抗原蛋白。

四种大豆球蛋白均能引起断奶仔猪过敏反应，起主要作用的是glycinin和β-conglycinin。据报道，给7日龄仔猪灌服大豆蛋白提取液，每天6 g，连续5 d，21日龄断奶后，喂以含有相应大豆蛋白的断奶日粮，在血清中测出了较高效价的抗glycinin和β-conglycinin的抗体（Li等，1990）。研究还发现给仔猪灌服大豆蛋白引起猪的小肠绒毛萎缩，隐窝细胞增生，同时导致消化吸收障碍、生长受阻以及过敏性腹泻（谯仕彦等，1995；谯仕彦和李德发，1996）。孙鹏（2006）分析了蒸汽处理对纯化大豆抗原蛋白活性的影响。孙泽威等（2005）探讨了大豆抗原蛋白对犊牛生长性能、日粮养分消化率和肠道吸收功能的影响。以上研究表明，大豆抗原蛋白对畜禽生产性能会造成一定的影响。

1.4.1 大豆抗原蛋白的提取分离与测定

李成贤等（2007）对大豆抗原蛋白的提取分离测定方法进行了综述。根据超速离心分析，用沉降系数S代表球蛋白组分(1 S = 10 – 13，S=1Svedberg 单位)，可分为2 S，7 S，11 S和15 S四种成分，大豆蛋白主要是7 S组分和11 S组分，其中7 S组分主要是β- conglycinin，而11 S组分主要是glycinin。自1962年Wolf等人首先利用饱和硫酸铵分级的手段得到纯度为91%~93%的11 S，球蛋白以来，根据抗原蛋白特性已建立了许多7 S球蛋白和11 S球蛋白分离及测定的方法，主要有:等电点沉淀法、冷沉淀法、盐析法、按离子强度不同而沉淀的分离法、免疫法（贾振宝等，2002；李德发，2003；彭楠等，2006）。

1.5 其他大豆抗营养因子与生物活性物质

在大豆和大豆制品中除胰蛋白酶抑制因子、凝集素、寡糖、抗原蛋白外，还含有植酸、单宁、抗维生素因子等抗营养因子，以及皂甙和异黄酮等活性物质。这些物质在大豆及大豆制品中的含量很少，抗营养作用较小。它们所引起的生理效应见于表1.1。

2 大豆中抗营养因子的去除方法

大豆中抗营养因子是影响大豆蛋白源在饲料中使用的主要因素，要提高大豆蛋白源在饲料中的使用量，必须采取合适的措施进行处理，使大豆抗营养因子失活、钝化。目前，世界范围内对降低或消除大豆蛋白抗营养因子问题的研究在不断完善，通常采用物理、化学和生物学等方法进行钝化处理。

2.1 生物学处理

生物学方法是通过添加适宜酶制剂或用微生物发酵处理以分解大豆中的抗营养因子。

2.1.1 酶制剂处理法

酶制剂有单一酶制剂和复合酶制剂。植酸酶是应用最广泛的单一酶制剂，能水解植酸和植酸盐，释放磷并使植酸抗营养作用消失；复合酶制剂如NSP 酶（非淀粉多糖酶），就能对多种ANF起作用，最大限度发挥饲料作用（赵林果等，2001）。但对酶制剂的耐受性、稳定性、影响酶制剂作用的外在因素等问题还有待进一步的研究与开发。另外，酶制剂处理时，添加酶的量要适量，过量会扰乱消化道的正常消化机能而产生不良作用。

2.1.2 生物发酵处理

微生物在发酵过程中可产生水解酶、发酵酶和呼吸酶，可以消除植物蛋白原料中的抗营养物质，有利于动物的消化吸收。另外，微生物在发酵过程中还将大部分动物不能直接利用的植酸等无机盐转化为细胞中的有机盐，不仅提高了利用率，还可降低饲料中总磷等的含量，减少饲料对养殖环境的污染。发酵法具有以下特点：能对多种抗营养因子产生去毒效果；对营养组分体外降解，大幅提高各营养成分的消化吸收率；发酵处理可明显提高大豆的适口性，有一定的诱食效果。采用独特的菌种和发酵工艺，微生物发酵过程中分泌的蛋白酶使大豆蛋白被分解成小分子蛋白和小肽分子。生物发酵过程中，微生物大量增殖，其结果不仅提高了发酵大豆蛋白基料的蛋白质水平，而且部分大豆蛋白质发酵时转化为菌体蛋白，这本身也改变了大豆蛋白质的营养品质（李绍章等，2004）。微生物发酵处理目前已有产品问世，但对产品的品质控制、发酵工艺参数控制以及规模化生产方面良莠不齐。陈名洪等（2008）以脱脂豆粕粉为原料，使用具有产蛋白酶能力的菌株CHD21为生产菌种进行发酵。以水解度作为指标，对菌株CHD2发酵降解豆粕的条件进行了优化。

2.1.3 育种法

通过植物育种途径，培育低抗营养因子或无抗营养因子的植物品种以及改善大豆蛋白品质，但这些大豆的产量相对较低，所以推广难度相对较大。另外一方面是通过动物育种，提高家畜对抗营养因子的耐受性；通过转基因培育能分泌消化抗营养因子的品系，达到消除抗营养因子对畜禽的抗营养作用。但存在产量低、抗病害能力降低、周期长、投资大等问题。

2.2 物理处理

物理处理的方法主要包括热处理方法和机械加工方法。

2.2.1 热处理方法

自1917年，Osborne和Mendel报道蒸煮大豆可以改善小鼠的生长性能以来，人们对大豆营养因子的热稳定性进行了大量研究，结果表明：胰蛋白酶抑制因子、糜蛋白酶抑制因子、凝集素、脲酶、致甲状腺肿因子及抗维生素因子具有对热敏感的特性，而皂甙、单宁、异黄酮、寡糖、致过敏反应蛋白及植酸等对热较稳定（李德发，2003）。所以热处理技术对蛋白酶抑制因子、凝集素、脲酶等热敏性抗营养因子有很好的钝化效果，也是目前研究最为深入、应用最为广泛的钝化技术。热处理主要分为湿热法和干热法（郑爱娟等，2002）。

进行热处理时，必须保证热处理的强度适宜。加热不足则抗营养因子破坏不够；加热过度则氨基酸利用率下降，会降低蛋白质的生物学效率。实际生产中多以测定脲酶活性判断胰蛋白因子的钝化程度，反应加热不足；采用蛋白溶解度作为判断大豆或豆粕加热过度的指标。

2.2.2 机械加工处理

机械加工包括粉碎、去壳、脱种皮等，很多抗营养因子主要存在于作物种子表皮层，通过机械加工处理使之分离，即可大为减少抗营养作用。此方法简单有效，但废弃种皮的处理是一个大问题。

2.3 化学处理

化学处理的原理为化学物质与抗营养因子分子中的二硫键结合，使其分子结构改变而失去活性。使用的化学物质包括硫酸钠、硫酸铜、硫酸亚铁和其它一些硫酸盐。近年来，人们在用化学方法钝化抗营养因子方面取得了较大的进展。张建云等（1999）研究表明，5%的尿素加20%水处理30 d的效果最好，胰蛋白酶抑制剂活性降低78.55%，饲料中加入适量蛋氨酸或胆碱作为甲基供体，可使单宁甲基化，促使其排出体外。化学方法对不同的抗营养因子均有一定的效果，可节省设备与资源，但最大的障碍是化学物质残留和环境污染的问题，因此生产中不应大量使用。

总结以上钝化抗营养因子的方法，就目前研究状况来看，从钝化的有效性，实用性出发，热处理是应用最广泛的方法，但在工艺上仍需继续精进，且对于热稳定性高或热加工不足以有效地灭活的抗营养因子，人们必须要不断地研究新的方法加以消除。大豆优良品种的选育是消除抗营养因子的根本，培育专门化品种解决大豆及豆制品适口性和品质问题，然而要达到理想的结果，尚需很长时间的努力。至于化学钝化，与生产应用尚有距离，还应特别关注化学钝化试剂的安全性问题。由于豆粕蛋白来源量大，相对于鱼粉来讲价格较低，是饲料配比中主要的蛋白来源，目前尚无更好的替代品，因此能够利用生物酶体例如微生物发酵产生的酶类来大量去除大豆抗营养因子，增加豆制品的适口性及有机体对豆制品的消化率，降低抗营养因子，亦能够为大豆及其制品的生产节省大量费用的比较切实可行的办法就是将豆粕进行发酵。

3 豆粕和发酵豆粕的营养特性

3.1 豆粕的特性

我们知道豆粕是大豆经提取豆油后得到的副产品。根据提取方法不同可分为一浸豆粕和二浸豆粕：用浸提法提取豆油后得到的副产品为一浸豆粕；压榨取油后再经过浸提取油后得到的副产品称为二浸豆粕。一浸豆粕的生产工艺较为先进，蛋白质含量高。是目前国内外现货市场上流通的主要产品。有以下特性：①物理性质。浅黄色至浅褐色。②化学成分。豆粕中含蛋白质43%左右、赖氨酸2.5%~3.0%、色氨酸0.6%~0.7%、蛋氨酸0.5%~0.7%、胱氨酸0.5%~0.8%、胡萝卜素0.2~0.4 mg/kg、硫胺素3~6 mg/kg、核黄素3~6 mg/kg、烟酸15 ~30 mg/kg、胆碱2200~2800 mg/kg。豆粕中蛋氨酸较缺乏。粗纤维主要来自豆皮，无氮浸出物、B族维生素与淀粉含量低，矿物质含量少。

3.2 发酵豆粕的特性

发酵豆粕是为提高豆粕消化率，降低其抗营养因子，经一定工艺和技术手段发酵后的豆粕。发酵豆粕具有以下优点：提高了豆粕蛋白的溶解度，利于消化；减小了豆粕中蛋白的分子量，其中的一部分已达到小肽水平甚至氨基酸水平，可以直接被动物吸收；发酵豆粕具有一定的芳香气味和鲜味，有一定的诱食作用，适口性较好；豆粕中一些多糖分子在发酵过程中被分解，这对于动物的消化吸收也很有利。特别是一些胀气因子，也被微生物在发酵中降解，这是其他工艺所不能达到的。

发酵豆粕的指标要求：发酵豆粕中蛋白质的KOH溶解度为95%以上；多糖也可以溶解；气味与口感及适口性良好，无豆腥味。学者们通过采用不同的方法研究发酵豆粕，采用各种检测技术来评定发酵豆粕的质量以及对用其饲养动物的效果进行了评定。Cho等（2007）将144头平均出生重为8.09 ± 0.05 Kg的断奶仔猪分为四个处理组，对照组饲喂基础日粮，处理组分别饲喂用5%、10%、15%的发酵大豆蛋白替代基础日粮中的豆粕后得到的日粮，得出的结论是饲喂10%、15%的发酵大豆蛋白替代日粮，饲料效率，氨基酸消化率，血尿氮和血中总蛋白浓度都得到提高。Kim等用240头出生重为5.16 ± 0.07 Kg的断奶仔猪做了相同的实验，结论是随着发酵大豆蛋白添加量的增加，生长性能和养分消化率提高的幅度增大，对肠道形态没有影响。有研究通过测定一些指标将未发酵的豆粕和分别用植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和酿酒酵母发酵后的豆粕产品进行比较，如分析四种样品的pH值和微生物含量，通过ELISA和western blot测定大豆过敏个体血清中的IgE的免疫活性，采用HPLC分析产品中的总氨基酸含量等，发现通过发酵产品pH降低，产乳酸细菌增多，大豆中免疫球蛋白的免疫活性降低，大部分氨基酸的含量会有所增加，只有少部分的氨基酸会因发酵类型的不同而变化（Song等，2008）。

4 发酵豆粕采用的菌种要求

为了得到优质的发酵豆粕产品，首先应对所要使用的菌种有严格的要求。发酵所采用的菌种应有如下优势：①菌种价格低廉，操作简便，易于制取；②菌种的生命力强大，容易形成生长优势，抵抗其他不利菌群的繁殖，发酵条件粗放，节约设施投资；③菌种中分解蛋白质的酶活力高，可以快速分解大豆蛋白为小分子蛋白，菌中还有相当丰富的分解淀粉、纤维等多糖物质的酶，而且还能分解其中的抗营养因子，提高了其中碳水化合物的消化率和利用率。

将豆粕分别用植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和酿酒酵母发酵，经测定豆粕用植物乳杆菌发酵后，得到的产品的pH最低，而经酿酒酵母发酵后，蛋白水平提高的幅度最大，且限制性必需氨基酸的水平提高最显著（Song等，2008）。所以在选择发酵用菌种时，我们应该综合生产条件、经济因素和发酵效果，确定发酵所用的菌种组合。

总之，发酵豆粕除了具有优于大豆的加工特性（保湿性、发泡性、非酸沉性等）与无豆腥味等特性外，还具有易消化、吸收快、抗原性低等许多独特的生理功能。

值得强调的是，豆粕发酵技术必须对发酵的程度进行了选择和确认。发酵程度并不是越深越好，而要考虑到成本问题。在保证效果较好的前提下，尽可能降低产品水分含量，因为要考虑产品干燥的成本。

5 总结

作为畜禽主要饲料原料的大豆在现实生产中发挥着极其重要的作用。但大豆中存在的多种抗营养因子降低了大豆的利用水平。经过几十年的研究，尽管人们对大豆中营养因子的化学结构和理化特性、生理作用、抗营养机制有了一定的了解，抗营养因子的钝化技术也有所发展，但是在大豆及大豆制品的实际运用中，还有很多问题没有得到解决。我们希望结合动物医学、免疫学、营养学等方面研究的发展，找到消减大豆抗营养因子活性的最佳方法，尽量解决大豆产品应用的相关问题。从发酵工艺方面着手，是值得考虑的。

豆粕中抗营养因子及其消除方法

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