发酵银杏叶对斜带石斑鱼生长性能、血浆生化指标与肝脏抗氧化指标的影响_微生物试验报告与运用_微生物知识

发酵银杏叶对斜带石斑鱼生长性能、血浆生化指标与肝脏抗氧化指标的影响

2021-06-17 14:51:24 点击：

摘要：本试验旨在研究发酵银杏叶对斜带石斑鱼生长性能、血浆生化指标与肝脏抗氧化指标的影响。配制添加不同水平[0（对照）、0.25%、0.50%]发酵银杏叶的饲料,投喂初始体重为12.6g的斜带石斑鱼8周,每种饲料投喂3个网箱（重复）,每个网箱投放30尾鱼。结果显示:

1）生长性能指标各组间均没有显著差异（P>0.05）。

2）与对照组相比,饲料中添加0.25%或0.50%发酵银杏叶均可显著降低血浆谷丙转氨酶（ALT）活性（P<0.05）；饲料中添加0.50%发酵银杏叶还可显著降低血浆谷草转氨酶（AST）活性（P<0.05）。

3）与对照组相比,饲料中添加0.25%或0.50%发酵银杏叶均可显著降低肝脏丙二醛（MDA）含量（P<0.05）,显著提高肝脏超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性（P<0.05）；饲料中添加0.50%发酵银杏叶还可显著提高肝脏过氧化氢酶（CAT）活性（P<0.05）。由此可见,饲料中添加0.25%或0.50%发酵银杏叶对斜带石斑鱼的生长性能无负面影响,还可提高斜带石斑鱼的肝脏抗氧化能力,且添加水平为0.50%时效果优于添加水平为0.25%时。

斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）是鲈形目（Perciformes）鮨科（ Serranidae）石斑鱼属（Epineph-elu）的一种名贵的海水经济鱼类,在我国福建、广东与海南等地广泛养殖,具有较高的经济价值。近年来,随着养殖规模的逐步扩大,海区水质的变化以及不合理使用化学药等问题导致养殖斜带石斑鱼成功率低、效益差,因此研究开发新型饲料添加剂对石斑鱼养殖业的健康可持续发展有重要意义。据已有研究表明,药用植物中的活性成分以黄酮类、多糖与萜类内酯化合物为主,可以通过提高机体抗氧化能力、抑制肿瘤坏死因子释放和抑制细胞凋亡等作用对机体施加影响。发酵药用植物能够提高药效,减少副作用,消除不良味道,具有广阔的发展前景。研究表明微生物发酵能够降低银杏叶中的银杏酸等毒性成分,从而降低毒副作用,同时提高黄酮类与萜类内酯化合物的比例,从而提高药效。研究发现,在团头鲂饲料中添加发酵银杏叶能够提高其生长性能、肠道消化酶活性、免疫能力及抗氧化能力；一定比例的银杏叶一辣木叶发酵物能够作为饲料蛋白质源替代异育银鲫饲料中的鱼粉,并且可提高增重率与肝脏抗氧化能力。但发酵银杏叶在斜带石斑鱼饲料中的应用研究尚鲜有报道,本实验室前期的研究已在细胞水平证实发酵银杏叶对于石斑鱼的肝脏细胞具有较好地保护作用,但缺乏体内试验的验证。因此,本试验通过投喂斜带石斑鱼添加不同水平发酵银杏叶的饲料,探究发酵银杏叶对斜带石斑鱼生长性能、血浆生化指标和肝脏抗氧化指标的影响,为发酵银杏叶在斜带石斑鱼饲料中的应用提供理论依据。

材料与方法

1 试验动物

斜带石斑鱼幼苗,购买于福建省漳州市漳浦县某石斑鱼育苗场。

2 试验材料

银杏叶购于厦门市某大药房,短小芽孢杆菌由某大学水产学院动物营养与饲料实验室馈赠。按李泽鑫等的方法,用浅盘培养法制备发酵银杏叶。

3 试验饲料的制备

以鱼粉、大豆浓缩蛋白作为蛋白质源,鱼油、大豆磷脂作为脂肪源,制作基础饲料,在基础饲料中分别添加0（对照组）、0.25%（试验1组）、0.50%（试验2组）的发酵银杏叶配制试验饲料,制成直径为2.5mm的颗粒饲料,保存于-20℃冰箱待用。试验饲料组成及营养水平见表1。

4 饲养管理与样品采集

试验鱼暂养2周后,挑选大小基本一致、鳞片完整且采食正常的斜带石斑鱼270尾,初始体重为12.6g,随机放入9个体积为100cm×60cm×80cm的网箱中,每个网箱30尾。将9个网箱同置于一个长方形水泥池中,随机分成3组,每组3个网箱（重复）。饲养试验持续8周,每天08:00和16:00进行饱食投喂,每2d进行1次吸粪,养殖水源为过滤海水,水温22.5-30.0℃,溶解氧浓度大于5.7mg/L。

养殖试验结束后,经过24h禁食,将每个网箱的试验鱼分别捞出称重,每个网箱随机捞取6条鱼用MS-222麻醉,尾静脉采血,全血（01%肝素钠抗凝）收集在离心管中,离心（2500m/min）10min后收集血浆,于-80℃冰箱保存；采血后解剖取肝脏称重后于-80℃冰箱保存。

5 指标测定

5.1 生长性能指标

根据试验所测定和记录的数据计算增重率（weight gain rate,WGR）、特定生长率（specific growth rate,SGR）、摄食率（daily feeding intake,DFI）饲料效率（feed efficiency ratio,FER）、肝体比（hepaticsomatic index,HSI）、成活率（survivalrate,SR）。生长性能指标的计算公式如下：

增重率（%）=100×（Wt-W0）/W0；

特定生长率（%/d）=100×（lnWt-lnW0）/t；

摄食率（%/d）=100×Wf/（Wt/2+W0/2）/t；

肝体比（%）=100×W1/Wt；

成活率（%）=100×Nf/Ni。

式中:W0为试验鱼的初始体重（g）；Wt为试验鱼的终末体重（g）；Wf为摄食饲料的总量（g）；W1为肝脏重量（g）；t:为投喂天数（d）；Ni为试验初始鱼尾数；Nf为试验终末鱼尾数。

5.2 血浆生化指标

血浆碱性磷酸酶（AKP）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）活性与总胆固醇（T-CHO）、总蛋白（TP）含量采用相应试剂盒测定,试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

5.3肝脏抗氧化指标

肝脏过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活性以及丙二醛（MDA）含量采用相应试剂盒测定,试剂盒购于南京建成生物工程研究所。肝脏蛋白质含量采用喹啉酸（BCA）法蛋白质定量测试盒测定,测试盒购于南京建成生物工程研究所。

6 数据处理与分析

试验数据用平均值±标准误（mean±SE）表示。采用SPSS 20.0软件进行数据统计和分析,先对数据进行方差齐性检验,如满足方差齐性条件则对数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA）,若组间存在显著性差异,则采用 Duncan氏法进行多重比较检验组间差异显著性,以P<0.05表示差异显著。

结果

1 饲料中添加不同水平的发酵银杏叶对斜带石斑鱼生长性能的影响

由表2可知，包含增重率、特定生长率、肝体比在内的各生长性能指标在各组之间均没有显著差异（P>0.05）。

2 饲料中添加不同水平的发酵银杏叶对斜带石斑鱼血浆生化指标的影响

由表3可知,饲料中添加0.25%或0.50%发酵银杏叶对斜带石斑鱼血浆中AKP活性与T-CHO、TP含量均无显著影响（P>0.05）。与对照组相比，饲料中添加0.25%发酵银杏叶对血浆中AST活性没有产生显著影响（P>0.05）,但添加0.50%发酵银杏叶则使血浆中AST活性显著下降（P<0.05）；此外,饲料中添加0.25%或0.50%发酵银杏叶均可显著降低血浆中ALT活性(P<0.05)。

3 饲料中添加不同水平的发酵银杏叶对斜带石斑鱼肝脏抗氧化指标的影响

由表4可知,添加发酵银杏叶的2个试验组的肝脏SOD活性均显著高于对照组(P<0.05),且肝脏SOD活性有随发酵银杏叶添加水平增加而升高的趋势;肝脏GSH-Px活性随着发酵银杏叶添加水平的增加而显著升高(P<0.05);肝脏CAT活性在发酵银杏叶添加水平为0.50%时达到最高,显著高于未添加发酵银杏叶和发酵银杏叶添加水平为0.25%时（P<0.05）；饲料中添加0.25%或0.50%发酵银杏叶均使得肝脏MDA含量较对照组显著降低（P>0.05）。

讨论

逯岩等发现在团头鲂饲料中添加0.25%或0.50%发酵银杏叶均能够显著提高团头鲂幼鱼的增重率与特定生长率,并可降低饲料系数。而在本试验中,在斜带石斑鱼饲料中添加0.25%或0.50%发酵银杏叶,对其增重率、特定生长率、摄食率与成活率均未产生显著影响。Tan等在石斑鱼的高脂饲料中添加0.05%～0.40%银杏叶提取物并未显著改变其增重率、特定生长率、摄食率与成活率,与本试验结果类似。这可能是由于石斑鱼属于肉食性鱼类,饲料中会添加高比例的鱼粉来提高饲料中蛋白质的品质,使得石斑鱼的生长性能达到较高水平,再提高较难,这说明发酵银杏叶在石斑鱼上呈现出的主要作用可能在于提高免疫能力或抗氧化能力方面,并且在0.25%与0.50%添加水平下不会对其生长性能产生负面影响。

血液中T-CHO的含量能够在一定程度上揭示鱼体脂类代谢的情况,反映肝脏的健康程度,当鱼体脂肪代谢紊乱、肝脏受到损伤时,血液中T-CHO的含量往往会升高,Yan等研究发现,银杏多糖能够抑制非酒精性脂肪肝引发的代谢紊乱；Jeong等研究表明,银杏叶提取物有减少脂类在肝脏过度沉积的作用；Tan等在珍珠龙胆石斑鱼的高脂饲料中加入0.05%-0.20%银杏叶提取物后,显著降低了血液中甘油三酯（TG）、T-CHO与肝脏粗脂肪含量；而本试验中,在斜带石斑鱼饲料中添加0.25%或0.50%发酵银杏叶后,相比对照组,肝体比有降低的趋势,血浆T-CHO含量有所下降,且有随着添加水平的增加而降低的趋势,但差异均未达到显著水平,可能是本试验中各试验饲料中碳水化合物、粗脂肪等营养成分含量适中,故未形成显著差异。此外,本试验发现,饲料中添加发酵银杏叶有降低中血浆AKP活性、T-CHO与TP含量的趋势,表明发酵银杏叶中的活性成分有影响机体蛋白质合成与脂肪代谢的作用,降低无机磷源的吸收与营养物质的转运效率，如果过量添加可能会影响鱼体正常的生长发育。

AST与ALT是肝脏内的2类重要的转氨酶，在氨基酸的代谢中起重要作用,当肝细胞结构受到破坏时,AST与ALT作为肝细胞的胞内酶,进入到血液中,所以血液中AST与ALT的活性可以代表肝脏的健康状态。张硕等的研究发现药用植物所含的黄酮类化合物具有抗四氯化碳（CCl4）致小鼠肝纤维化的作用，能够显著降低小鼠血液中AST与ALT活性,而黄酮类化合物又是发酵银杏叶中的主要成分之一。本试验中,在斜带石斑鱼饲料中添加0.25%的发酵银杏叶时,血浆中AST活性相对对照组略有下降而ALT活性则显著降低,发酵银杏叶添加水平为0.50%时,血浆中AST与ALT活性相对对照组均显著降低,说明发酵银杏叶具有维持斜带石斑鱼肝脏细胞正常结构与功能的作用,但同时也降低了氨基转移活力,这也是添加发酵银杏叶未能提高斜带石斑鱼生长的原因之一。

机体中的SOD能够催化超氧阴离子（O2-）歧化为过氧化氢（H2O2）和氧气（O2）；GSH-Px是一种在还原过氧化物过程中起重要作用的酶,能够降低过氧化物对机体的伤害；体内产生的H2O2经过CAT催化分解或利用,避免氧化损伤；MDA是具有细胞毒性的物质,是体内过氧化过程的最终产物,其含量的升高反映体内抗氧化能力。曹建等的研究表明,银杏叶有降低血液MDA含量与提升SOD活性的作用；太海燕等的研究发现,银杏叶提取物可以通过降低肝脏MDA含量缓解小鼠的急性酒精性肝损伤,Niu等的研究表明在肉鸡饲粮中添加发酵银杏叶可以提升肝脏GSH-Px和SOD活性,从面提高肉鸡肝脏的总抗氧化能力。本试验数据显示,摄食添加发酵银杏叶饲料的斜带石斑鱼,其肝脏SOD、GSH-Px、CAT活性显著高于对照组，MDA含量显著低于对照组,且0.50%添加水平较0.25%添加水平作用更为明显,表明发酵银杏叶对于提升斜带石斑鱼清除自由基能力与抗氧化能力有显著作用,这可能是银杏叶中的有效生物活性成分黄酮类、银杏多糖与萜类内酯化合物共同发生作用的结果,其具体机制还有待进一步研究。

在我们前期的离体试验中发现,发酵银杏叶对H2O2诱导的斜带石斑鱼肝细胞损伤具有显著的保护作用,能够显著降低细胞上清液中AST与ALT的活性,并显著提高细胞GSH-Px活性与总抗氧化能力,显著降低细胞MDA含量,本试验结果进一步印证了离体试验的结果。

结论

饲料中添加发酵银杏叶并未对斜带石斑鱼的生长性能产生负面影响,还能够提高斜带石斑鱼的肝脏抗氧化能力,且添加水平为0.50%时效果优于添加水平为0.25%时。

【产品特点】本品是专门针对水生动物的生理特性而设计的复合益生菌与复合酶制剂，特别是针对水生动物类消化系统的特点，采用原籍高活力乳酸菌，其抗逆性强，具有很强的活力，从而能够达到满意的使用效果。连续使用本品后能够提高鱼类的采食量和提高消化吸收率，不仅健康问题明显减少，死亡淘汰率降低，且增长、增重效果非常明显（对比数据显示：相同的饲料和规格的草鱼，连续使用本品后提前半月左右达到规定的重量），并且能够改善鱼类肉品质，提高经济效益。

【性状】灰白色或淡黄色粉末。

【适用范围】高密度网箱养殖、高密度鱼塘养殖、水库养殖等各种水产动物，在四大家鱼、罗非鱼、海参、鲍鱼、鳗鱼、泥鳅、黄鳝、虾类、龟鳖、蛙类等特种鱼类养殖上均反馈效果明显。广泛适用于海水、淡水养殖。

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2.促进消化吸收，降低饲料消耗：益生菌代谢产物中具有丰富的消化酶，可以提高饲料消化吸收率，使鱼类充分利用饲料中的营养，促进鱼类健康增长和增重效果显著。

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4.使用本品后可有效减少或不使用抗生素，改善水生动物肉质，提高成活率，养殖品种色泽好，活力强，整齐度高，肉质好，能形成水生动物健康生态养殖模式，提高商品性能，生产健康安全的水生动物产品。

本品所用菌株稳定性好，抗逆性强，具有耐热、耐酸、耐胆汁、无污染、无违禁物质、绿色环保的特点，可长期使用。

【用法用量】

1.喂粉状饲料时，直接添加到饲料中；喂粒状饲料时，可将本品1包加水2-5公斤溶解后与部分（50-100公斤）先饲喂，再饲喂未添加益生菌的饲料；或将溶解的益生菌洒在全部（500公斤）颗粒料上简单混合一下后投喂。

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2.喂滤食性水生动物或贝类，可将本品用养殖池塘水浸泡3小时以上（浸泡活菌的水最好加入1%的糖）直接泼撒；喂蛙类时由于是悬浮膨化饲料，需要将本品先放入5公斤清水中激活6小时以上（放入500g红糖效果更好，激活24小时效果最佳），然后将激活的菌液洒在50-100公斤饲料中先饲喂，剩余的400-450公斤饲料正常饲喂，目的是将益生菌加入到其中。