导读

乳酸菌是发酵糖类且主要产物为乳酸的一类无芽孢和革兰染色阳性细菌的总称，乳酸菌广泛存在于自然界和人和动物的消化系统中，几乎所有菌型都对人和动物无毒无害，可维护人和动物的身体健康。乳酸菌具备多种有益功能，其在医药、生物技术、食品和饲料等领域已得到广泛应用。截至2010年，我国乳酸菌产业规模已经超过200亿元，产量突破160万t。在养殖业中，抗生素的使用日渐威胁人类健康和环境安全，世界各国已普遍禁用或限用饲用抗生素;此外，微生物饲料添加剂已经在畜禽养殖业中得到广泛地认可和使用，其中最受推崇的微生物饲料添加剂之一就是乳酸菌。乳酸菌在动物体内能发挥许多生理功能，有促进动物生长，调节胃肠道正常菌群，维持微生态平衡及改善胃肠道的功能，可提高食物消化率和生物效价，降低血清胆固醇及控制内毒素，抑制肠道内腐败菌生长，提高机体免疫力及防治多种肠道疾病。2008年12月中华人民共和国农业部1126号公告《饲料添加剂品种目录(2008)》中规定可直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂菌种:地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸性乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母、沼泽红假单胞菌和保加利亚乳杆菌，共16种，其中11种为乳酸菌。

尽管乳酸菌在养殖业中意义重大，但其作为生物饲料添加剂的规模还比较小，目前市场份额约为10亿元，其主要原因在于目前乳酸菌的研究和应用更多地集中在发酵乳制品(益生菌酸奶、益生菌发酵乳饮料和益生菌奶酪)、发酵豆乳制品、功能性食品配料、食品添加剂(在婴儿配方乳粉、中老年乳粉和果汁等中的添加等)和膳食补充剂(片剂和胶囊等)等方面上，研究方向更多地集中在发酵菌剂的研制和使用等。规模的局限也造成乳酸菌饲料添加剂研发滞后。要为消费者提供更多健康的肉类食品，就必须加快乳酸菌工业化生产的研究。目前乳酸菌饲料添加剂的规模化生产需要解决3个问题，原料廉价易得，最好是废弃的农副产品;工艺低碳环保，尽量减少能源消耗和二次污染;操作简便，不需添加外源物质，如都符合就能生产出高密度的乳酸菌，为此研究者们不懈努力。刘晓红等以玉米粉和麦麸等为固态基质，对一株植物乳杆菌进行固态混合发酵试验，培养结束后乳杆菌活菌数可达100亿CFU/g;方芳等以玉米粉、豆粕和麦麸为基质对保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌进行固态混合发酵试验，40℃时得出最好发酵结果，各活菌数超过10亿CFU/mL。许赣荣等明一种利用糖渣培养乳酸菌及生产乳酸活菌饲料的方法，以玉米淀粉制糖工业副产物糖渣为主要原料，添加麸皮和蛋白胨等物质，采用固态分批液态分批或液态补料的方式，研制出液态培养活菌含量超过10亿CFU/mL，固态培养活菌含量超过10亿CFU/g的乳酸菌剂。然而对照规模化生产需要解决的3个问题，上述研究离目标要求还有一定距离。在我国，每年都有数以万t的菠萝渣、罗汉果渣、烧仙草渣、马蹄淀粉废水及马蹄渣等农产品加工废渣，量大且相对集中，对其进行资源化利用的意义十分重大。研究植物乳杆菌对上述农副产品废渣的利用情况，同时发现一种利用马蹄淀粉废水及马蹄渣生产乳酸菌饲料添加剂的新方法。

1材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌种

植物乳杆菌，实验室分离保存，标记为LP199，菌剂为干粉状，活菌含量400B/g。

1. 1. 2 农副产品废渣

菠萝渣(菠萝经压榨机压榨取汁后的果渣)，罗汉果渣(鲜罗汉果经浸提压榨后的果渣，主要为罗汉果核)，烧仙草渣(烧仙草干草经浸提后的草渣)，马蹄淀粉废水(马蹄经匀浆、去渣和流槽沉淀后的废水)，马蹄渣(马蹄匀浆经浆渣分离再作压滤后之渣)。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 可资源化利用农副产品废渣的快速筛选

取0.40 g 植物乳杆菌菌剂，加入至1 000 mL灭菌氯化钠注射液中，混匀，制得1亿CFU/mL 的菌种液。将菌种液按1∶10 分别接种于下列试验编号的样品中。

1 号: 450 g 菠萝渣，加入450 mL 蒸馏水，置于1 000 mL广口瓶中; 2 号: 450 g 罗汉果渣， 加入450 mL 蒸馏水， 均质， 置于1 000 mL广口瓶中; 3 号: 450g 烧仙草渣，加入450mL 蒸馏水，均质，置于1 000 mL 广口瓶中; 4 号: 900 mL 马蹄淀粉废水， 置于1 000mL广口瓶中; 5 号: 450 g 马蹄渣，加入450mL 蒸馏水，置于1 000mL广口瓶中。密封置30 ℃发酵24 h，进行感官、菌相镜检及pH 测定，其中pH 用检定合格的pH 计测定。5个样品同时另备一份，相应编号为A、B、C、D 和E，进行发酵前的感官、菌相镜检及pH 测定。选取发酵后色泽和气味较好、革兰阳性短杆菌较多且纯及pH 较低的样品作为植物乳杆菌可资源化利用的基质。

1. 2. 2 植物乳杆菌LP199 对选用基质营养成分利用的试验

对筛选出的基质，重复1.2.1 中试验，检测其发酵前后的总糖、蛋白质、总酸( 以乳酸计) 、乳酸、脂肪、淀粉、粗纤维和膳食纤维等营养成分，并分析前后变化。相关方法根据国家标准GB /T5009.8—2008、GB 5009.5—2010、GB/T 12456—2008、SN/T 2007—2007、GB/T 5009.6—2003、GB/T 5009.9—2008、GB/T 5009.10—2003 及GB/T 5009.88—2008进行。对固体废渣进行氨基酸检测，分析发酵前后变化。对氨基酸的检测按国家标准GB /T5009.124-2003方法进行。

1.2.3 选择基质生产乳酸菌剂的试验

试验前，现场取样，测可溶性固形物、pH、镜检和菌落总数。可溶性固形物用手持式折光仪直接读数，菌落总数按国家标准GB 4789.2—2010方法检测。试验时，将植物乳杆菌菌种液按1∶10 直接接入基质中过夜进行一级放大，再按同比例接种培养，发酵24 h，测镜检、感官、pH 及乳杆菌数，同时作对照试验。

2结果与分析

2. 1 可资源化利用的农副产品废渣快速筛选结果

利用植物乳杆菌LP199 对菠萝渣、罗汉果渣、烧仙草渣、马蹄淀粉废水及马蹄渣等进行发酵试验，结果见表1。

试验所用菌种LP199，为一种植物乳杆菌，系革兰阳性杆菌，分散排列，菌体大小( 0. 8～1. 0) μm×( 1. 0～2.0) μm。菌种LP1999 在菠萝渣中未能占据主导地位，大量生长的是一种革兰阳性链杆菌; 罗汉果渣发酵后总体菌量较少，并且酵液发臭; 烧仙草渣接种培养后呈现混合菌相，pH 未能明显下降，且出现产气和腐烂味; 因此上述3 种废渣均不适合作为生产乳酸菌剂的基质。马蹄淀粉废水和马蹄渣发酵后，其pH 迅速下降，具有特殊发酵的酸香味，菌体主要为植物乳杆菌，故研究首先选取此2 种物质作为培养植物乳杆菌的基质。

2. 2 植物乳杆菌LP199 对马蹄淀粉废水和马蹄渣营养成分的利用结果

将菌种LP199 接种于马蹄淀粉废水和马蹄渣中，检测其发酵前后总糖、蛋白质及总酸等营养成分含量，结果见表2。

发酵后，马蹄淀粉废水和马蹄渣总糖接近0，而总酸大幅增加。总酸成分主要为乳酸，马蹄淀粉废水中乳酸与总酸的比为82%，马蹄渣中乳酸与总酸的比为98%，说明菌种LP199 是同型乳酸发酵，如此高质量分数的乳酸足以抑制或杀灭其他细菌，为其免于对基质的热处理从而实现低碳发酵奠定基础。

发酵前后，蛋白质、脂肪和淀粉的含量没有明显变化，提示菌种LP199 与其他大多数乳酸菌一样，缺乏这些物质的分解酶系，其生长所需因子主要来源于马蹄淀粉废水和马蹄渣中已有的营养物质，同时也说明马蹄淀粉废水和马蹄渣的利用前景广阔。试验同时检测的还有马蹄渣发酵前后氨基酸的含量，结果见表3。

马蹄渣经菌种LP199 发酵后，其氨基酸含量由4.400 g /100 g 增加至5.743 g /100 g，总量增加30. 50%。氨基酸中，只有胱氨酸减少，其余全部增加，增加超过50%的有谷氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸，其中后5 种氨基酸为畜禽必需氨基酸。氨基酸含量的变化反映出菌种LP199 复杂的生理代谢作用，因为氨基酸本身就是乳酸菌的良好底物，所以发酵后氨基酸含量的增加可能来源于菌体的增加，表明菌种LP199 是一种优良的单细胞蛋白。

2.3 马蹄淀粉废水及马蹄渣生产乳酸菌剂试验结果

将菌种放大一级后再分别接种于马蹄淀粉废水和马蹄渣中，自然环境条件下密封放置，试验结果见表4。试验于2012 年12 月23 日和2013 年2 月1 日在宏源公司生产现场进行2 次，日平均气温20 ℃ ～15 ℃，结果取2 次试验数据的平均数。

从表4 可见: 马蹄淀粉废水和马蹄渣基质中，含有一定的杂菌，数量超过100 万CFU/( mL·g-1) ，主要是一些革兰阳性小球菌， 如不接种菌种LP199，24 h 后，该菌会大量繁殖，菌体密度超过10 亿CFU/( mL· g-1) 。而接入10% 的菌种LP199 一级放大菌液后，菌种LP199 的生长数量居于主导地位，培养液中几乎全为植物乳杆菌，由于没有其他外源菌，表中乳杆菌的数量就是菌种LP199 的数量，它在马蹄淀粉废水中的纯度是91. 70%，在马蹄渣中的纯度几乎是100%，而且密度较高，活菌数超过10亿CFU/(mL·g-1)。

目前由于我国还没有乳酸菌菌剂的国家或行业标准，如以中华人民共和国农业部光合细菌菌剂的标准作为生物菌剂的判定依据，可发现试验得到的乳酸菌菌剂数量的杂菌率均满足其要求，是一种优良的生物饲料添加剂，特别是马蹄渣中还含有大量的膳食纤维(见表2)，更凸显其作为饲料添加剂的优越性。

3讨论

研究发现一种利用马蹄淀粉废水和马蹄渣生产植物乳杆菌饲料添加剂的新方法，该方法具有原料廉价易得、工艺低碳环保和操作简便可行等特点，由此生产的生物饲料添加剂可广泛应用于畜禽和水产养殖。

植物乳杆菌属于乳杆菌属，其营养要求比较复杂，需要氨基酸、核酸衍生物、维生素和可发酵的糖等，因此并非所有的农副产品废渣都可被其利用，如菠萝渣、罗汉果渣和烧仙草渣等，废弃柑橘和柿子则更难被利用。研究发现，马蹄淀粉废渣是培养植物乳杆菌LP199 的优良基质。马蹄淀粉加工过程中产生的废水和废渣， 可溶性固形物达1.50%～2.00%，实际上可看作是马蹄匀浆的上清液( 因废渣含水量也达到79.60%) ，其中蕴含着丰富的营养物质，非常适合植物乳杆菌的生长，植物乳杆菌接种至马蹄淀粉的废水和废渣后，能迅速增殖，产生大量的乳酸，pH 低于4.0，抑制和杀灭其他微生物，使杂菌率控制在10%以内，这一培养特性可用于生物饲料添加剂的工业化生产，因其不需添加任何外源物质，不需任何热处理措施，甚至可做到0排放。

与马蹄淀粉废水相比，马蹄渣作为基质更有利于植物乳杆菌LP199 的增殖，利用后不仅活菌含量更高，且菌物更纯，纯度几乎可达100%。有趣的是，马蹄渣接种植物乳杆菌LP199培养后，其氨基酸含量增加30. 50%，这可能是由于菌体蛋白的增加造成的，这一结果表明菌体本身可作为高质量的单细胞蛋白。然而由于氨基酸的总含量不高，因此其应用意义更多地在植物乳杆菌的大量增殖足以达到发挥对动物的益生作用，同时通过改善马蹄渣的营养成分，增加其适口性，从而增加其作为生物饲料添加剂的性价比。

采用一级放大，二级10%的接种量，自然环境条件下直接培养，无需任何特殊的工艺，即可将马蹄淀粉废水和马蹄渣变为活菌含量超过10亿CFU/(mL·g-1)的乳酸菌饲料添加剂。由于乳酸菌对环境敏感，不易保存，因此还需对其活性保存条件作进一步研究。

以年产2 000 t 马蹄淀粉来计，马蹄淀粉废水和马蹄渣量将分别约达到1.20 万和0.45 万t，其量大，且相对集中，因此对其进行资源化利用生产乳酸菌饲料添加剂前景广阔，马蹄湿渣中还含有13.50 g /100 g 的膳食纤维，折合干物质基础含量为67.60 g /100 g，这将大幅增加其作为生物饲料添加剂的潜在价值。