菜粕是菜籽榨油后的副产物，其中粗蛋白含量为35%~40%，与豆粕蛋白相比蛋氨酸和胱氨酸含量更高，且含有丰富的金属元素，如铁、锰、铜、钙、磷、硒等，是一种价廉易得的优质植物蛋白资源。但菜粕中含有多种抗营养因子，如硫苷、植酸、芥酸和单宁酸等，限制了其在食品、饲料行业中的应用。其中硫苷为主要的抗营养因子，分解后会生成恶唑烷硫酮、异硫氰酸酯、腈等有毒物质，这些物质对动物甲状腺、肝、肾都会产生毒害作用。植酸主要能与蛋白质、铜、锌、钙等营养物质结合形成难以消化的络合物，降低菜粕的营养价值。另一方面，由于菜粕蛋白中小肽含量低，相比于豆粕、鱼粉蛋白更难被消化。因此，降低菜粕中抗营养因子硫苷、植酸含量并提高小肽含量，对提高菜粕的营养价值，解决蛋白质原料供应紧缺的问题具有重要意义。

为了改善菜籽粕的营养价值，国内外许多学者对菜粕的脱毒方法进行了大量研究，包括物理脱毒法、化学脱毒法、微生物发酵法和遗传育种法。微生物固态发酵法经济高效、重现性好，近年来常被用于菜粕脱毒、提取菜籽抗氧化肽等。CROAT等利用正己烷预处理菜粕后，通过里氏木霉30℃发酵168h后将菜粕中硫苷降至0.4μmol/g。但存在有机试剂残留，发酵时间长等问题。MAHAJAN等通过添加纯酶制剂降解植酸、硫苷，其降解率分别达到71%、60%。但通过添加纯酶制剂处理菜粕降解抗营养因子，一方面降低了酶和底物的耦合度使得酶解效率低下，另一方面也增加了处理成本。

目前大部分研究侧重于通过微生物一步发酵法降解抗营养因子，但未考察过通过发酵后结合酶解的方式进一步降解菜粕中抗营养因子，提高营养物质。由于黑曲霉具有产酶系较全且安全性高的特点，并符合农业部颁布的安全发酵菌株要求，因此，本实验选择一株能降解硫苷、植酸的黑曲霉发酵菜粕，发酵结束后利用黑曲霉在发酵过程中产生的各种酶进一步酶解发酵后的菜粕，通过发酵、酶解两步法降低菜粕中的抗营养因子硫苷和植酸含量，提高菜粕中小肽含量。

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

黑曲霉，购买于中国工业菌种保藏中心(CICC)。

1.1.2 原料

菜籽粕(水分含量10.57%)、麸皮(水分含量9.31%)，乐山某科技有限公司。

1.1.3 培养基

保藏培养基:察氏琼脂培养基(质量分数)

蔗糖3%;

NaNO3 0.3%;

K2HPO4 0.1%;

MgSO4·7H2O 0.05%;

KCl 0.05%;

FeSO4 0.001%;

琼脂1.5%~2%;

121℃灭菌20min。

黑曲霉麸皮种子培养基:麸皮∶水=2∶1(g∶mL)，自然pH;混匀取30g装500mL三角瓶，121℃灭菌15min。

发酵培养基:菜粕(绝干)∶麸皮(绝干)∶水=7∶3∶15(g∶g∶mL)，自然pH;混匀取60g装于500mL三角瓶，121℃灭菌15min。

1.2 仪器设备

T-114 型分析天平;

T6 紫外-可见分光光度计;

QYC-2102C 型恒温培养摇床;

MF 80BSH-2 型霉菌培养箱;

LS-75HD 立式高压蒸汽灭菌器;

SW-CJ-2F 型超级洁净工作台;

K9840自动凯氏定氮仪。

1.3 试验方法

1.3.1 种子制备

勾取5~7环保藏的黑曲霉接种于种子培养基中，混匀，30℃恒温培养72h。

1.3.2 固态发酵

将黑曲霉麸皮种子以5%(质量分数)的接种量接种于发酵培养基中，混匀，30℃恒温培养;发酵一定时间后取30g发酵菜粕于70℃烘干至恒重，粉碎过40目筛网测定指标。

1.3.3 酶解

取固态发酵结束后的30g发酵菜粕装入自封袋，45℃密闭恒温酶解24h;之后将菜粕于70℃烘干至恒重，粉碎过40目筛网测定指标。

1.3.4 发酵、酶解时间对硫苷、植酸含量的影响

固态发酵时间:分别考察发酵一定时间(12、24、36、48、60、72h)和发酵相应时间并酶解24h后硫苷、植酸含量的变化情况。酶解时间:考察经一定时间发酵并经过不同时间(0、6、12、18、24、30、36h)酶解后硫苷、植酸含量的变化情况。

1.3.5 底物组成、表面活性剂、初始发酵水分对硫苷、小肽含量及产酶的影响

底物组成:考察发酵底物中麸皮与菜粕的比例(0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6)对发酵后产酶及酶解后硫苷、小肽含量的影响。

表面活性剂:考察含水混合发酵底物中不同吐温80添加量(质量分数0%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%)对发酵后产酶及酶解后硫苷、小肽含量的影响。

初始发酵水分:考察不同初始发酵水分(51%、55%、59%、63%、67%、71%)对发酵后产酶及酶解后硫苷、小肽含量的影响。

1.3.6 数据分析

采用SPSS 22.0进行单因素方差分析，用Duncan检验法进行显著性多重比较，试验结果采用平均值±标准误差表示，以P＜0.05作为差异性显著判断标准。

2.结果与分析

2.1 发酵时间对硫苷、植酸含量变化的影响

如表1所示，经过酶解后，硫苷，植酸含量相比于单步固态发酵明显降低，且发酵时间对降解硫苷、植酸的影响十分明显。发酵前36h，硫苷、植酸含量基本不变，发酵至48h时硫苷含量降至最低;当发酵时间超过48h，植酸含量随发酵时间的增加而下降，但硫苷含量随发酵时间增加。将经过各时间发酵后的菜粕进一步酶解，相比于单步发酵，除发酵12h外，硫苷、植酸含量均明显降低。发酵48h后继续酶解24h，硫苷含量降至最低，相比于固态发酵降低了30.51%，植酸含量降解至1mg/g以下。

发酵前36h，黑曲霉产生降解硫苷、植酸的酶量少，经酶解后只有少量硫苷、植酸被降解;发酵至36～48h，黑曲霉大量分泌降解硫苷、植酸的酶，经酶解后硫苷、植酸均降至最低水平;发酵60～70h后酶解，硫苷含量相比于发酵48h后酶解显著增加(P＜0.05)。到发酵后期，碳水化合物被大量消耗，蛋白质成分富集，也可能导致硫苷含量相对增加。发酵48h后酶解的硫苷、植酸含量均处于最低水平，因此选择48h为最佳发酵时间。

2.2 酶解时间对硫苷植酸含量变化的影响

将发酵的菜粕继续酶解后，硫苷和植酸进一步被降解，结果如表2所示。经过6 h酶解后，相比于黑曲霉单独发酵48h，植酸含量降低了69.88%;酶解12h后，植酸含量从1.40%降低至0.1%以下，王晓东等使用黑曲霉单步固态发酵菜粕将植酸从2.81%降低至0.63%，本研究结果优于王晓东等的研究结果。酶解前12h，硫苷降解速率较快，12h后降解速率相对减慢。可能是由于12h后，可降解的底物浓度减少且45℃保温时间过长使相关酶酶活下降，从而导致硫苷降解速率下降。当经过24h酶解后，硫苷含量降低至12.13μmol/g，且不随酶解时间增加而变化(P＞0.05)。

发酵过程中，黑曲霉产生的植酸酶可能受到温度及底物平衡等条件限制导致植酸降解效果不好。当酶解温度升高时，植酸酶分解植酸的能力也有较显著的提高，且植酸的降解不受黑曲霉生长代谢影响，因而使得大量植酸易在短时间内被分解。与降解植酸不同，可能在黑曲霉固态发酵过程中产生的分解硫苷的酶类有限，因此在酶解过程中不能将硫苷完全降解。再经过24h酶解后硫苷和植酸含量均不再发生变化，因而选择酶解24h为最佳酶解时间。由于经酶解后，植酸几乎完全降解，因此后续研究主要通过优化菌酶协同条件进一步降解硫苷，同时提高小肽含量。

2.3 底物组成对降解硫苷提高小肽含量的影响

麸皮作为一种良好的碳源及营养物质，适量混入菜粕中能使底物变得疏松透气，有利于黑曲霉在发酵过程中生长产酶。如图1-a所示，麸皮∶菜粕=2∶8和3∶7时，黑曲霉发酵酶解后硫苷含量差异不显著(P＞0.05)，且当麸皮∶菜粕=3∶7时，菜粕中的小肽含量最高(P＜0.05)。如图1-b所示，麸皮∶菜粕=3∶7时，黑曲霉发酵后蛋白酶活最高，因此麸皮∶菜粕=3∶7可能是黑曲霉生长产酶最适碳氮比。因为麸皮∶菜粕=3∶7时黑曲霉产蛋白酶活最高，所以酶解后小肽含量也最高。当麸皮比例超过底物的40%后，可能因为麸皮的添加量增大使得发酵底物中硫苷及可降解的大分子蛋白质含量相对减少，导致硫苷及小肽含量均呈现下降趋势。综上，麸皮∶菜粕=3∶7有利于降解硫苷及提高小肽含量和产酶量，因此确定麸皮与菜粕的比例为3∶7。

2.4. 添加表面活性剂对降解硫苷，提高小肽含量的影响

在菜粕与麸皮的混合底物中加入适量的吐温80有利于提高蛋白酶酶活和小肽含量，结果如图2-a所示。当在麸皮菜粕混合底物中添加0.05%的吐温80进行发酵酶解后，小肽含量明显增加，相比于未添加吐温80，小肽含量提高了42.66%，但硫苷含量无明显差异(P＞0.05)，可能由于菜粕中剩余的硫苷种类无法被此株黑曲霉产生的酶分解，因此硫苷含量变化不大。图2-b结果表明，小肽含量变化与蛋白酶活变化趋势相似。黑曲霉在含有0.05%～0.2%吐温80的混合底物发酵后，酸性蛋白酶显著提高，再经酶解后，菜粕中大分子蛋白质进一步被分解为小分子肽，因此小肽含量显著提高。由于添加0.05%～0.2%的吐温80对小肽及硫苷含量无显著影响(P＞0.05)，因此确定吐温80最适添加量为0.05%。

2.5 初始发酵水分对降解硫苷提高小肽含量的影响

如图3-a所示，当初始发酵水分低于67%时，小肽含量随水分增加而增加，当水分超过67%时，小肽含量明显下降(P＜0.05)。初始水分在55%～71%，经发酵酶解后，硫苷含量无明显变化(P＞0.05)。图3-b结果表明，初始水分的变化对蛋白酶活的影响不显著(P＞0.05)，且酶解后，小肽含量的变化与蛋白酶活的变化趋势不同。根据WANG等报道，菜粕中的蛋白质被纤维素形成的结构所包裹，在酶解过程中，小肽的产生可能也受纤维素酶影响。因此当水分过高时，纤维素酶活力下降(图3-b)，导致酶解后小肽含量下降。虽然黑曲霉于67%的初始水分发酵酶解后小肽含量最高，但由于水分过高，底物结团严重，且易污染杂菌，不利于扩大生产，因此确定最佳的初始发酵水分为59%～63%，为方便后续试验，确定最佳初始发酵水分为60%。

2.6 灭菌和不灭菌对发酵酶解后营养成分和抗营养因子含量的影响

表3结果表明，黑曲霉在灭菌与不灭菌的菜粕麸皮混合培养基(初始发酵水分 60%、吐温80添加量0.05%)中发酵酶解后，除小肽含量外，硫苷、植酸、粗蛋白含量均无明显差异(P＞0.05)。同时结果表明，未灭菌发酵对硫苷、植酸的降解及小肽含量的提高效果均优于灭菌后发酵，推测由于灭菌后导致培养基中部分营养成分流失，使得黑曲霉发酵效果变差。最终经未灭菌的麸皮菜粕混合培养基发酵酶解后，硫苷含量从31.38μmol/g降解为11.31μmol/g，植酸含量从34.45mg/g降低至1mg/g以下，小肽含量提高至21.19%，占粗蛋白含量的49.92%。

3.结论

通过对发酵、酶解时间，发酵酶解、产酶条件优化后，确定了最优固态发酵时间、酶解时间分别为48h、24h，菜粕与麸皮比例、吐温80添加量、初始发酵水分分别为7∶3、0.05%、60%。与单步固态发酵相比，经菌酶协同处理的菜粕，硫苷、植酸含量分别降低了33.20%、96.18%;与空白对照相比，硫苷、植酸含量分别降低了63.96%、97%以上;同时，菜粕中小肽含量提高至21.19%，相比于空白和单步发酵分别提高了74.98%和673.36%。综上，菌酶协同处理菜粕后，有效降低了菜粕中抗营养因子硫苷、植酸含量，大幅提高了小肽含量，对扩大菜粕蛋白的使用具有重要意义。

实战操作技术——棉菜籽饼脱毒变身优质饲料替代豆粕操作新技术

当前豆粕价格很高有些地方货源紧缺，而棉菜籽饼（棉籽粕、菜籽粕）价格相对便宜，棉菜籽饼是棉子、油菜籽榨油后剩下的饼状残渣，蛋白质含量较高，含有各种氨基酸成分。但由于棉菜籽饼中含有植酸、芥子碱等物质，这些物质含有一定的毒性，还会影响动物的消化吸收，不能大量使用，因此不建议直接饲喂给动物！

现在通过微生物饲料发酵剂的除毒脱毒技术，可以成功将菜籽饼变为优质添加饲料，直接按照1公斤发酵的棉菜籽饼（发酵前的重量）代替约0.85公斤豆粕进行使用。饲料发酵剂中的有益微生物，在发酵过程中分泌的代谢产物，可将棉菜籽饼中的毒性物质等有效分解。

豆粕、菜粕、棉粕成分对比

1.豆粕是一种高蛋白原料，无需脱毒即可用作饲料。其中蛋白质含量为40%-48%，赖氨酸含量为2.5%-3.0%，色氨酸含量为0.6%-0.7%，蛋氨酸含量为0.5%-0.7%。2020年11月12日报价每吨在3500元左右。

2.菜粕的粗蛋白含量在34%-38%之间，特点是蛋氨酸含量高（仅次于芝麻饼、粕），赖氨酸含量亦高。而精氨酸含量低，是饼、粕饲料中含量最低的。菜籽粕的有效能值偏低（淀粉含量低、菜籽壳难以消化利用）。矿物质中，钙和磷的含量均高，硒和锰的含量亦高。特别是硒的含量是常用植物饲料中最高的。2020年11月12日报价每吨在2900元左右。

3.棉粕蛋白质含量一般为44.32%，仅次于豆粕的蛋白质含量48%，而高于菜籽粕的蛋白质含量36.04%。精氨酸含量高达3.6%-3.8%，而赖氨酸含量仅有1.3%-l.5%，只有豆粕的一半。2020年11月12日报价每吨在3000元左右。

是否需要脱毒处理

1.豆粕无需经过脱毒即可用作饲料。而且豆粕中富含蛋白质和多种氨基酸，在不需要额外加入动物性蛋白的情况下，仅豆粕中含有的蛋白质和氨基酸足以平衡家禽和猪的食谱，促进它们的营养吸收。只有当其他粕类单位蛋白成本远低于豆粕时，豆粕才有可能被替代。

2.菜粕菜籽中含有硫葡萄糖苷、芥酸、单宁、皂角苷等不良成分，其中主要是硫葡萄糖苷。硫葡萄糖苷本身无毒，但在一定温度和水分条件下，经过菜籽本身含有的芥子酶的酶解作用而产生异硫氰酸酯、唑烷硫酮和腈类等有害物质。这些物质可引起甲状腺肿大，从而造成动物生长速度下降，繁殖力减退。单宁则妨碍蛋白质的消化，降低适口性。而芥酸阻挠脂肪代谢，造成心脏脂肪蓄积及生长受到抑制。。使用前需进行一定的脱毒处理，并且使用时要加以限制，具体喂量应根据菜粕中有害成分含量而定。经过脱毒处理的菜籽粕喂量可以加大，而“双低”油菜籽生产的菜粕喂量要受限制。同时，应结合菜粕的氨基酸组成特点，适当搭配其它饼粕。

3.棉籽中含有对动物有害的棉酚及环丙烯脂肪酸，尤其是棉酚的危害很大。在制油过程中，由于蒸炒，压榨等热作用，大部分棉酚与蛋白质、氨基酸结合而变成结合棉酚，结合棉酚在动物消化道内不被动物吸收，故毒性很小。另一部分棉酚则以游离形式存在于饼、粕及油品中，这部分游离棉酚对动物毒性较大，尤其单胃动物过量摄取或摄取时间较长，可导致生长迟缓、繁殖性能及生产性能下降，甚至导致死亡。幼小动物对棉酚的耐受能力更低。由于棉籽饼、粕中游离棉酚对动物有害，因此，在使用棉饼、粕时，要根据饲喂对象及饼粕中游离棉酚的含量加以限量。反刍家畜在有优质粗料及多汁青料的情况下，棉籽饼、粕的用量不受限制，不会造成中毒。对单胃动物要限制喂量，最好使用经过脱毒处理的棉籽饼粕。同时，使用棉籽饼、粕配制饲粮要注意氨基酸平衡，尤其是棉籽饼、粕的赖氨酸含量低，且利用率差，应注意添加赖氨酸。

发酵操作技术

发酵棉菜籽饼其实也是一个脱毒技术，具体操作如下：

1.仔细检查棉菜籽饼，剔除棉菜籽饼中严重变质发霉的部分，轻度发霉的原料可以忽略，因为微生物发酵能够脱霉。

2.将棉菜籽饼粉碎并添加适量的玉米粉淀粉类的能量饲料等，调节饲料营养比例。

3.每吨棉菜籽饼加入2公斤食盐、玉米粉（其它淀粉、面粉次粉等也可以，或者粉碎的生红薯300公斤也可以）100公斤、“99多功能饲料发酵剂”1包（500g/包，市场售价约25元，以高浓度乳酸菌、酵母菌、复合酶制剂的专业发酵剂）。

4.在混合物料中添加适量水分，使混合物料含水量保持在55%左右，以“手抓一把并紧握，无水滴落，松手后轻触即散”为宜，一般上述配方中需要加入清水约500-600公斤。

5.发酵方式根据实际环境条件各异，在桶、缸、塑料袋等容器中发酵均可。

6.发酵时要尽可能排尽空气进行密封发酵。如果使用的发酵容器有密封不严实的隐患，要在一开始就在其外层包裹一层塑料袋并扎紧。发酵过程中不能启封。

7.发酵时间受环境温度影响，通常夏季发酵2-3天，冬季发酵5-7天即可完成。发酵完成后，有较为强烈的酸香味，ph值在3-4。

规模运用混合发酵现场

塑料缸、饲料袋（有内膜）均可做发酵饲料

采用池子发酵

发酵完成的棉菜粕饲喂动物技术

需要注意的是，发酵后的饲料酸度较低，不可以取代禽畜全部日粮。其他类发酵饲料同理。饲喂时根据不同情况，将发酵饲料按照一定比例添加到日粮中，发酵完成的棉菜粕为湿料，具体使用量每大概1.5-2公斤发酵棉菜粕（湿料）代替动物日粮配方中1公斤豆粕的使用量进行代替使用，与其它饲料混合后直接饲喂，由于棉菜籽粕蛋白较高，最高使用量不要超过禽畜日粮饲喂量的40%（湿料重量）。如果发现发酵饲料过酸适口性变差，可在饲喂前在阳光下晒1-2小时，或添加适量的碳酸氢钠（小苏打）即可改善。

发酵过程中与发酵后使用过程中，发酵的容器要一直保持密封状态，可以长时间保存（一年左右）。

当前养殖业成本高居不下，而饲料成本是其中最高的，利用廉价原料发酵饲料（包括一些轻度发霉的粕类低价收回）是极佳解决办法。通过微生物饲料发酵剂的发酵作用，可以将轻度霉变饲料变成优质饲料，将不易消化的物质分解为可被畜禽吸收的小分子糖类、氨基酸等。同时发酵饲料中富含有益微生物、酶制剂、酸化剂等，可调节畜禽肠胃微生态环境并进一步提高饲料利用率。发酵饲料气味清香，提高了饲料的适口性，加上发酵饲料中有大约4℃的酒度，能够促进动物新陈代谢促进健康抵御疾病，是当前养殖业发展中重要的一环。

本技术也可以同样发酵菜籽粕（饼）、棕榈粕等，方法同上。

【视频】部分发酵饲料养猪鸡鸭带给你无臭味健康无抗养殖效果

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