发酵饲料中抑菌菌种筛选及抑菌性能评估方法的初步研究
摘要：试验通过牛津杯法筛选出抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌性能较强的一株乳酸菌L3和两株芽孢杆菌D9、K9。将其用于制作发酵饲料，提升发酵饲料的抑菌性能。试验初步研究发酵饲料的体外抑菌性能评估方法。结果表明，用80%的乙醇溶液作为发酵饲料的前提取溶剂可增加抑菌物质的溶解，浓缩提取液的浓度可使发酵样品的抑菌效果更加明显。
对全国养殖业与饲料业而言，2020年是极其特殊又极具挑战的一年。从年初非洲猪瘟的大面积爆发到农业农村部7月份明令叫停饲料企业对抗生素的生产和使用，这些现实与困难迫使人们从饲料配方到养殖模式都急需找到能替代抗生素的产品与技术。在此大背景下，人们把研究方向和重点转向发酵饲料的优化升级，以此替代抗生素在饲料中的作用。对抗生素的依赖主要因其可通过抑止有害微生物的繁殖，进而维持动物机体健康，提高消化吸收利用率。发酵饲料正是通过菌酶协同等方式与致病菌竞争营养进而抑止有害微生物在动物体内定植，起到抗菌、防病的功能，还可调节机体肠道菌群平衡，改善肠道环境。
发酵饲料又称微生物发酵饲料。可见，微生物在发酵饲料中起到至关重要的作用，菌种的选择是发酵饲料品质的前提与关键。发酵饲料的优化从根本也是菌种的性能筛选与合理配伍。我国农业农村部在《饲料添加剂品种目录》中规定在饲料中可用的微生物菌株达30余种。目前。发酵饲料使用的菌种主要以酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌为主。文章研究在发酵饲料常用菌中筛选出抑制以金黄色葡萄球菌与大肠杆菌为代表的致病菌性能较强的菌株，进而用筛选出的菌株优化提高发酵饲料的抑菌性能。近年来，许多学者对发酵菌种的单菌菌液抑菌能力评估深入研究，而对发酵饲料本身的抑菌性能评估方法及研究鲜少涉及。文章在采用琼脂扩散牛津杯法评估发酵饲料的体外抑菌性能的基础上优化测定方法，充分提取发酵饲料本身的抑菌物质，更大程度上体现出发酵饲料的抑菌性能，供广大学者和饲料企业参考与使用。
1.材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验菌种
乳酸菌（1×1010CFU/g）：L1、L2、L3;芽孢杆菌（1×1011CFU/g）：K1、K3、K9、D1、D3、D9、Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6，以上菌种均为公司实验室保藏菌种。
1.1.2 指示菌
金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus,S.a）ATCC26003、大肠杆菌（Escherichiacoli,E.coli）ATCC44102。
1.1.3 培养基及试剂
液体培养基：MRS液体培养基、营养肉汤培养基、LB液体培养基。平板培养基：LB固体培养基。
1.1.4 器皿及用品
三角瓶、直径（90±0.1）mm的培养皿、1mL移液枪、100μL移液枪、内径 （6±0.1）mm的牛津杯、镊子、无菌棉棒、游标卡尺等。
1.1.5 试验仪器设备
光学显微镜（上海彼爱姆光学仪器制造有限公司）、高速离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）、冰箱（奥克斯集团有限公司）、气浴恒温振荡器（常州澳华仪器有限公司）、生化培养箱（北京永光明医疗仪器有限公司）、旋转蒸发仪（上海亚荣仪器有限公司）、干燥箱（北京永光明仪器有限公司）、分析天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］、高压灭菌锅（上海申安医疗器械有限公司）、超净工作台［林茂科技（北京）有限公司］。
1.2 试验方法
1.2.1 试验菌液制备
乳酸菌菌液制备：取乳酸菌菌粉0.1g接种至150mLMRS液体培养基中，在生化培养箱37℃静置培养24h后将菌液离心，10000r/min离心10min，取上清液备用。芽孢杆菌菌液制备：取芽孢杆菌菌粉0.1g接种至150mL营养肉汤培养基，37℃、140r/min摇床培养24h后将菌液离心，10000r/min离心10min，取上清液备用。
1.2.2 指示菌菌悬液制备
将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别接种至LB液体培养基中，37℃过夜培养12~15h，显微镜下观察活菌生长情况，将其稀释至5×107CFU/mL菌悬液低温备用。
1.2.3 指示菌平板的制备
涂布平板法：向已灭菌的培养皿中倾注20~25mL的LB固体培养基，水平静置凝固，分别接种100μL金黄色葡萄球菌与大肠杆菌菌悬液，用棉棒涂布均匀后晾干低温放置备用。
1.2.4 发酵菌种抑菌性能筛选
采用琼脂扩散牛津杯法测定发酵菌种抑菌活性。将牛津杯垂直放于已制备好的两种指示菌平板上，用镊子轻压使其与培养基表面紧密接触，分别向牛津杯中加入200μL试验菌种上清液，先室温静置1h后放于37℃生化培养箱培养12~18h，观察并用游标卡尺测量抑菌圈直径大小。每组测定两个平行，最后结果取平均值。抑菌圈直径越大，表明该菌种抑菌性能越强。
1.2.5 发酵饲料样品的制备
将筛选出的抑菌性能较强的乳酸菌和芽孢杆菌按一定量混合成复合菌粉添加到饲料中，将复合菌粉与饲料原料混合，加入温水制成水分为40%的样品，40℃发酵4d，即为试验发酵样品。
1.2.6 发酵样品抑菌性能评估方法
1.2.6.1发酵样品浸提液的制备
准确称取发酵样品和饲料原料各100g，按照1:3体积比分别加入蒸馏水、80%无水乙醇、pH值7.5的缓冲溶液，在42℃，120r/min的条件下震荡浸提3h，3 000r/min离心10min，收集上清液备用。
1.2.6.2发酵样品浸提液的浓缩
取试验组与对照组的上清液样品各100mL，分别旋转蒸发浓缩后定容至50 mL，浓缩液收集备用。
1.2.6.3发酵样品抑菌性能评估
将用不同溶剂浸提的试验组与对照组的浸提液与浓缩液用琼脂扩散牛津杯法评估抑菌性能，方法同文章1.2.4。
2.结果与分析
2.1 发酵菌种抑菌性能筛选
2.1.1 乳酸菌抑菌性能评估（见图1、表1）
由图1、表1可知，3株乳酸菌对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有抑制作用，与杨柳等的研究结果相符。其中L3乳酸菌的抑菌效果最为明显，产生的抑菌圈直径最大，对大肠杆菌的抑菌圈直径达1.96cm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为1.98 cm。因此，后期选择L3乳酸菌作为制备抑菌发酵饲料的乳酸菌菌种。
2.1.2 芽孢杆菌抑菌性能评估（见图2、表2）
由图2、表2可知，芽孢杆菌对大肠杆菌均无抑制作用，D9、K1、K3、K9、Y4、Y5、Y6对金黄色葡萄球菌有不同程度的抑制作用，与陈洁梅等的研究结果相同，但与夏超笃等的研究结果不尽相同。这可能是因为芽孢杆菌属所包括的菌种类别较多，特性差异较大。有研究表明，2013年农业农村部公布饲用芽孢杆菌共有6株，其中用于养殖饲料发酵的芽孢杆菌主要包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌等。以上菌株虽同属芽孢杆菌属，但菌株特性不能一概而论，因此对不同致病菌的抑制能力也不尽相同。虽然Y4、Y5、Y6的抑菌圈直径较大，但抑菌圈呈现半透明的状态，表示其可能存在部分抑菌的可能性。因此选择D9、K9作为制作发酵饲料的抑菌芽孢杆菌。
2.2 发酵饲料抑菌性能评估
2.2.1 不同提取溶剂对发酵饲料抑菌评估结果的影响（见图3、表3）
关于发酵饲料的抑菌性能评估的资料大多是比较发酵饲料菌种的抑菌特性，而对发酵饲料本身的抑菌性能评估的相关研究较为少见。这是因为发酵饲料含有的抑菌物质复杂多样，而且未有较为合适高效的提取方式，因此，文章重点对发酵饲料的前提取方式进行研究。
前期研究多种相关影响条件，如：前提取时间、温度、稀释比例等，但是均未能达到理想效果。结果发现提取效果最为明显的因素是前提取溶剂的选择。
由图3可知，在相同条件下用蒸馏水、pH值7.5的缓冲溶液和80%的乙醇溶液对发酵样品进行提取，抑菌结果有明显差距。在前期试验证实以上3种溶剂对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均无明显抑制作用，所以可排除溶剂对抑菌效果的影响。
由表3可知，用80%乙醇溶液作为前提取溶剂，发酵样品的抑菌结果最佳。结果表明，发酵样品中的抑菌物质可能更易溶解于有机溶剂。
2.2.2 前提取液浓度对发酵饲料抑菌评估结果的影响（见图4、表4）
在选择80%乙醇溶液作为前提取溶剂的基础上，继续研究提取液浓度对样品抑菌性能的结果影响。由图4、表4可知，使用旋转蒸发仪对提取液进行浓缩对发酵样品的抑菌结果有所提升，而且从试验结果还可证明用乙醇溶液提取的饲料原料提取液同样无抑菌作用，凸显发酵饲料本身的抑菌优势。
3.讨论
文章通过比较实验室保藏的多株益生菌种菌液的抑菌性能，用琼脂扩散牛津杯法筛选出抑制金黄色葡萄球菌与大肠杆菌性能较强的一株乳酸菌L3和两株芽孢杆菌K9、D9。用这3株抑菌菌种制成复合抑菌菌粉，用于优化发酵饲料的抑菌性能。为评估发酵饲料的抑菌性能，文章针对发酵饲料的体外抑菌评估方法进行细化研究。研究表明，发酵饲料前提取溶剂选择对抑菌结果有明显影响，并发现用80%的乙醇溶液作为溶剂更易于提取发酵饲料中的抑菌物质，而且通过旋转蒸发浓缩提取液的浓度也可使发酵饲料的抑菌结果更为明显。
在今年全面“禁抗”的大趋势下，找寻抗生素替代品已是迫在眉睫。微生物发酵饲料的重要性也愈发凸显，用发酵饲料替代抗生素在饲料中的作用已成为当下的研究热点与主流。而发酵饲料的改进也不能停留在对抑菌菌种的筛选上，菌种间的协同配伍，酶制剂的合理使用都是后续需要深入研究的方向。体外抑菌评估方法还需进一步细化完善，要分清不同发酵饲料中抑菌物质的组成，才能针对性地选择更加合理的评估方式，将发酵饲料本身的抑菌性能完全展现。
4.结论
文章用琼脂扩散牛津杯法筛选出抑制金黄色葡萄球菌与大肠杆菌性能较强的一株乳酸菌L3和两株芽孢杆菌K9、D9。同时研究结果表明，发酵饲料前提取溶剂选择对抑菌结果有明显影响，通过旋转蒸发浓缩提取液的浓度也可使发酵饲料的抑菌结果更为明显。
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