随着我国饲料资源的日趋紧张及抗生素的禁用，积极寻找健康多元化的饲料资源及安全高效的饲料生产模式，成为了畜牧工作者亟待解决的首要任务。发酵饲料作为一种新型、绿色的环境友好型饲料，制作过程中有益微生物大量繁殖，可将饲料中蛋白质分解为氨基酸及小分子的肽，淀粉分解发生糖化、酸化，兼备微生态制剂、酶及糖化处理的功能。然而，发酵饲料在畜禽上应用的研究结果并非十分一致。大多研究表明，发酵饲料对畜禽日增重、饲料转化效率、免疫功能及肠道健康等方面均体现出一定的促进作用。另有结果显示，饲料中蛋白质经发酵脱羧产生生物胺，其过度积累将导致饲料适口性降低及氨基酸的不可逆损失。发酵饲料制作工艺的不同，是其饲用效果呈现多样性的重要原因，亦是其功能性评价成败的关键。因此，本试验采用固体发酵工艺制备固态发酵醋糟饲料(solid-state fermentation vinegar dregs，SFVD)，并研究其对育肥猪生长性能、养分表观消化率、血清指标及粪便中挥发性脂肪酸(volatile fatty acids，VFAs)含量的影响，以期为新型生物饲料的研发与应用提供数据参考。

1  材料与方法

1.1  试验材料

发酵菌种:布拉式酵母菌(Saccharomyces bou lardji)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)及地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)均由北京龙科方舟生物工程技术有限公司提供。

胰蛋白胨、酵母提取物购于英国 Oxoid 公司，氯化钠(NaCl)、葡萄糖购于国药集团化学试剂有限公司，乳酸细菌培养基(MＲS 培养基)购于北京奥博星生物技术有限公司。溶菌肉汤培养基(LB培养基)、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD培养基)组成见表 1。

1.2  试验设计与饲养管理

选择体况相近［(59.04±0.33)］kg 的健康“杜 × 长 × 大”三元杂交育肥猪 60 头，随机分为 2 个组，每组 3 个重复，每个重复 10 头猪，各重复间初始体重差异不显著(P ＞ 0.05)。基础饲粮参考NＲC(2012)营养需要配制，基础饲粮组成及营养水平见表 2.对照组饲喂基础饲粮 +150 mg /kg 土霉素钙，试验组饲喂基础饲粮 +5%的 SFVD。自由采食和饮水，预试期 6 d，正试期 35 d。

试验开始前对猪舍进行全面清扫、消毒，试验期间每周进行 1 次猪舍消毒。猪舍内环境温度维持在 20～25 ℃，相对湿度为 65%。猪只管理和免疫按常规进行。动物试验于 2018 年 12 月 6 日至2019 年 1 月 10 日在重庆市畜牧科学院动物营养研究所进行。

1.3  SFVD 的配制

据课题组前期研究结果，试验对 SFVD 制备工艺进一步优化:植物乳杆菌、地衣芽孢杆菌及布拉式酵母菌液分别接种于液体 MＲS(37 ℃静置培养 16 h)、LB(37 ℃、220 r/min 培养 16 h)和 YPD培养基(30 ℃、200 r/min 培养 24 h)培养后，分别以 1%接种量接种于发酵罐中，控制罐压、通气量、溶氧、pH 及温度等条件。装袋密封，室温厌氧发酵 5 d。饲料需于开袋后 15 d 内使用完毕，随用随取，随取随封，严防二次发酵及霉菌污染。发酵菌种的培养均采用先摇瓶、后发酵罐的扩繁模式。发酵罐容积 50 L，植物乳杆菌和地衣芽孢杆菌培养基添加量为 35 L /罐，布拉式酵母菌培养基添加量为 30 L /罐。布拉式酵母菌培养过程中，当溶氧解含 量 开 始 回 升 时，补料5 L，流 速 控 制 为30 mL /(h•L)。菌种的培养工艺详见表 3，生物饲料组成及营养水平见表 4。

1.4  样品采集与指标测定

1.4.1  生长性能测定

每天记录仔猪采食量，试验前后对仔猪进行称重，并根据以上数据计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.4.2  常规养分含量的测定

粪样、饲料样中的干物质( DM ) 含量采用105 ℃烘干法(GB /T 6435—2006)测定，粗蛋白质(CP)含量采用凯氏半微量定氮法(GB /T 6432—1994)测定，粗脂肪(EE)含量采用索氏乙醚提取法(GB /T 6433—2006)测定，粗灰分(Ash)含量采用 550 ℃ 灰化法(GB /T 6438—2007) 测定，粗纤维( CF) 含 量 参 照 GB /T 6434—2006/ISO 68652000 的方法测定;铬含量参照 GB /T 13088—2006的方法，经湿法消解(硝酸加高氯酸)处理后，使用原子吸收光谱仪(日立 －Z－5000，日立集团，日本)测定。

1.4.3  养分表观消化率的测定

在正试期第 30 ～ 35 天的饲粮中添加 0.3%的三氧化二铬(Cr 2O 3)作为外源指示剂，测定养分表观消化率。3 d 预试期后，于试验期第 33～35 天，每天从每个重复中选取有代表性的粪样约 200 g，－20 ℃保存。将 3 d 的粪样混合均匀，一部分用于VFA 含量的测定;一部分置于 65 ℃ 烘箱中 72 h，回潮 24 h 后，粉碎样品过 40 目，按照四分法取样500 g，－4 ℃保存待测。

养分表观消化率(%)= 100－［(饲粮中铬含量 × 粪中某养分含量) /(粪中铬含量 ×饲粮中某养分含量)］×100。

1.4.4  血样的采集、处理与测定

于正试期第 35 天晨饲前，每个重复选择 3 头猪，空腹经前腔静脉采血 15 mL 于真空促凝采血管中，倾 斜 静 止 30 min 后，4 000 r/min 离 心10 min，分离血清，－20 ℃ 保存，用于血清生化、抗氧化及免疫指标的测定。

谷 草 转 氨 酶 ( aspartate aminotransferase，AST)、谷 丙 转 氨 酶 ( alanine aminotransferase，ALT)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP) 活性及总蛋白(total protein，TP)、胆固醇(cholesterol，CHOL)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、尿素氮(urea nitrogen，UN)含量使用 COBUS MIＲA Plus 自动生化分析仪测定。

化学比色法测定谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和过氧化氢酶(catalase，CAT)活性以及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，酶联免疫吸附法测定免疫球蛋白 A(immunoglobulin A，IgA)和免疫球蛋白 G(immunoglobulinG，IgG)含量，所用试剂盒购于南京建成生物工程研究所，并严格按照试剂盒说明书操作。

1.5  数据处理

试验数据采用 SAS 9.2 软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间差异性及趋势性判定标准分别为 P＜0.05 和 0.05≤P＜0.10。

2  结果与分析

2.1 SFVD  对育肥猪生长性能的影响

由表 5 可见，与对照组相比，基础饲粮中添加5%的 SFVD 对育肥猪 ADFI 具有一定的促进趋势(P=0.056)，对 ADG 和 F/G 均没有显著影响(P＞0.05)。

2.2  SFVD 对育肥猪养分表观消化率的影响

由表 6 可见，与对照组相比，基础饲粮中添加5%的 SFVD 显著降低了育肥猪饲粮中 DM、CP、OM 和 GE 表观消化率(P＜0.05)，对 EE 表观消化率有一定的促进趋势(P= 0.052)，对 CF 表观消化率没有显著影响(P＞0.05)。

2.3  SFVD 对育肥猪血清生化指标的影响

由表 7 可见，与对照组相比，基础饲粮中添加5%的 SFVD 显著提高了育肥猪血清 AST 活性(P＜0.05)，血清AST /ALT 和HDL 含量也呈现出一定的升高趋势(P = 0.082 和 P= 0.055)，对血清ALT、ALP 活性及 TP、UN、CHOL、TG 和 LDL 含量没有显著影响(P＞0.05)。

2.4  SFVD 对育肥猪血清抗氧化和免疫指标的影响

由表 8 可见，与对照组相比，基础饲粮中添加5%的 SFVD 显著提高了育肥猪血清 GSH-Px 活性(P＜0.05)，对血清 SOD、CAT 活性及 MDA 含量均没有显著影响(P＞0.05);血清 IgA 含量呈现出一定的升高趋势(P = 0.077)，而对血清 IgG 含量没有显著影响(P＞0.05)。

2.5  SFVD 对育肥猪粪便中 VFA 含量的影响

3  讨 论

3.1  SFVD 对 育 肥 猪 生 长 性 能 和 养 分 表 观消化率的影响

饲料经发酵处理后，可将饲料中的大分子有机物降解为更容易被机体利用的小分子物质，同时产生大量菌体蛋白及多种代谢产物。其中，乳酸及多种 VFA 的存在使其具备酸香味，从而改善饲料适口性，逻辑上利于动物生长性能的提高。然而，发酵饲料对动物生长性能及养分消化率方面的研究结论却并不十分一致。

众多研究表明，发酵饲料对育肥猪、肉鸡、肉兔、朗德鹅、羔羊及肉牛的生长性能及表观消化率均表现出良好的促进作用。周映华等采用复合菌种(乳酸菌∶酿酒酵母∶枯草芽孢杆菌 =1∶1∶1)对育肥猪全价饲料进行发酵，结果显示，发酵饲料与基础饲粮 1∶4 混合使用，能够显著提高育肥猪的 ADG 和 ADFI，降低F/G，同时显著提高饲粮中 CP 和 CF 的表观消化率，这与 Hu 等的研究结果吻合。本试验结果发现，基础饲粮中添加 5%的 SFVD 使饲粮适口性得到改善，进而提高了育肥猪的 ADFI，这与前期众多报 道 一 致。此 外，基 础 饲 粮 中 添 加 5% 的SFVD 对育肥猪的 ADG 和 F/G 均没有造成显著影响，可能与饲粮中 DM、CP、OM 和 GE 的表观消化率降低有关。研究表明，饲粮中 CF 水平每提高1%，反刍动物 OM 的消化率降低 0.65% ～0.70%，单胃动物降低 1.35% ～1.40%，且不同纤维源对营养物质消化率的影响不同。本试验以醋糟和小麦麸为纤维源制作的 SFVD(CF 含量 16.4%)，基础饲粮中添加 5%的 SFVD 使育肥猪饲粮 CF 表观消化率提高了 0. 61%，OM 表观消化率降低了1.69%，这可能与所选纤维源不可溶非淀粉多糖(insoluble non-starch polysaccharide，INSP)含量较高有关。饲粮中可溶性非淀粉多糖(soluble non-starch polysaccharide，SNSP)含量过高可造成食糜的营养屏障效应，而 INSP 含量过高使食糜流通速度加快，是导致营养物质消化率降低的重要原因。因此，不同制备工艺的生物饲料对育肥猪生长性能及养分表观消化率的影响不同，而有关纤维组分与养分表观消化率间的相关性及其作用机理的研究，尚需进一步证实。

3.2  SFVD 对育肥猪血清生化指标的影响

血清生化指标是反映机体代谢及各组织器官功能的间接体现。正常生理状态下，ALT 和 AST分别主要存在于胞质和线粒体中，尤以肝脏和心肌细胞中活性最高。当细胞受损时，胞膜通透性改变，大量的 ALT 和 AST 涌入血液，致使血液中ALT 和 AST 活性升高。因此，ALT 和 AST 常被用作肝脏及心肌疾患检测的敏感指标。本试验条件下，基础饲粮中添加 5%的 SFVD 显著提高了育肥猪血清 AST 活性，提示可能对心肌细胞产生了负面影响，但由于 2 组血清 AST 活性均处于较低水平，临床学意义不大，故在此不做冗余讨论。此外，在血清 AST 和 ALT 活性均未出现显著异常的前提下，AST /ALT 的上升并不足以断定本研究过程中出现了肝损伤。

研究表明，饲喂发酵饲料能够提高猪血清 TP和 UN 含量，促进机体蛋白质的整体代谢，同时对血清 ALP 活性具有显著的促进作用，提示发酵饲料的使用对猪的生长发育具有潜在的促进作用。而本研究发现，基础饲粮中添加 5%的 SFVD并未对育肥猪血清 TP、UN 含量及 ALP 活性造成显著影响，这可能与发酵饲料的原料、工艺及使用量密切相关。值得一提的是，试验组血清中 HDL含量呈现出高于对照组的趋势，提示 SFVD 对育肥猪血脂代谢可能具有潜在促进作用，推测原因可能与 VFA 的大量产生有关，本研究结果与前人报道基本一致。此外，本试验条件下，2 组间血清 ALP 活性及 TP、UN、CHOL、TG 和 LDL 含量均未表现出统计学差异。

3.3  SFVD 对育肥猪血清抗氧化和免疫指标的影响

发酵饲料中含有丰富的微生物，可作为独立抗原，在刺激机体免疫系统和提高氧化应激能力等方面具有重要的作用。徐秀景等试验表明，采用乳酸菌发酵饲料饲喂生长育肥猪，能够提高血清中 GHS-Px 等抗氧化物酶活性，增强机体抗氧化能力。本试验条件下，基础饲粮中添加 5%的SFVD 显著提高了育肥猪血清 GSH-Px 活性，而对血清 SOD、CAT 活性及 MDA 含量均未造成显著影响。本试验采用的 SFVD 含有丰富的植物乳杆菌(2.7×10 7 CFU /g)等益生菌，可通过与金属离子螯合，降低羟自由基前体的含量，也能产生 GSH-Px、阿魏酸酯酶(FAE)以及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化酶，阻止高活性氧的形成，从而提高机体抗氧化能力。

此外，有研究表明，采用无抗生素发酵饲料饲喂断奶仔猪，可以通过增加小肠上皮间淋巴细胞、M 细胞和 CD3 + T 细胞数量，进而提高小肠的黏膜免疫 。本研究发现，试验组血清 IgA 含量呈现出一定升高趋势，提示 SFVD 也可能对育肥猪的黏膜免疫具有潜在的促进作用，这与 Ahmed 等的研究结果一致。尽管研究者对发酵饲料提高机体免疫功能的观点普遍认可，但其微生物与机体免疫间可能存在的对话机制仍有待畜牧工作者进一步探索。

3.4  SFVD 对育肥猪粪便中 VFA 含量的影响

肠道中微生物发酵产生的 VFA 主要以乙酸、丙酸和丁酸等短链脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)为主。报道显示，VFA 与肠上皮细胞的代谢、增殖分化、肝脏的脂质代谢等密切相关。值得强调的是，肠道中 VFA 总量的 95%可被吸收代谢，最高可提供宿主所需能量的9% 。本 研 究 显 示，基 础 饲 粮 中 添 加 5% 的SFVD 显著提高了育肥猪粪便中丙酸含量，粪便中甲酸和 TVFA 含量也呈现出一定的升高趋势，而对粪便中乳酸、乙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸含量没有显著影响。推测可能与饲粮结构的改变有关，一方面，试验组相对较高的纤维水平，为动物后肠道产 VFA 菌群提供了良好的培养基质;另一方面也可能与 SFVD 自身含有的高活菌数及VFA 有关，提示本工艺条件下的 SFVD 对肠道健康具有潜在的促进作用。

众多学者认为，VFA 可通过降低肠道 pH 来抵御感染及致病菌的侵袭。研究表明，饲喂发酵饲料可降低不同肠段肠杆菌科和沙门氏菌数量，提高乳酸杆菌数量，推测原因为发酵饲料使肠道中乳酸及 VFA 含量增加，导致 pH下降所致。菌体细胞内酸解离导致 pH 下降，从而致使酶和质子动力泵坍塌，辅以阴离子自身的杀伤效应，达到破坏菌体的效果。诚然，pH对肠道微生物区系的稳定至关重要，而另有学者认为，解离的乳酸和 VFA 不能自由穿越菌体膜，因而肠杆菌科和沙门氏菌数量的减少只与未解离的部分有关。尽管 VFA 对肠道健康的正面效应已被众多研究者普遍认可，但饲粮 － 菌群 －VFA轴的相关性尚不十分明确。有关饲粮对宿主肠道微生物的调控机制研究，将是本课题组接下来的重要探究内容之一。

4  结 论

基础饲粮中添加 5%的本工艺条件下制备的SFVD 对育肥猪生长性能、肠道健康及免疫性能的提高具有潜在的促进作用。

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