1.1 发酵饲料的制备

参照《中国猪饲养标准2004》肉脂型生长猪营养需要量，配制玉米－豆粕型基础日粮，日粮组成及其营养水平见表1。随后将日粮与水按55∶47的比例混合均匀，使水分含量达到50％左右，接种0.5％的发酵菌液，混合均匀后分装入发酵桶中密封，自然发酵3ｄ后即可使用，每桶拆封后3ｄ内用完。所用发酵菌液为短乳杆菌与地衣芽孢杆菌，二者比例为1∶1。

1.2 试验设计

试验于2017年4-5月在重庆市畜牧科学院动物营养研究所试验猪场进行。选取22ｋｇ左右，体重相近的（约克夏×荣昌猪二元杂交猪）生长猪90头，随机分成３组，每组6个重复，每个重复5头，经7ｄ预饲后，分别饲喂无抗日粮（对照组），含0.04％杆菌肽锌（有效含量为10％）的日粮（抗生素组），发酵全价日粮（发酵组），试验期30ｄ。试验期间，猪只自由采食和饮水，按猪场常规程序消毒免疫。

1.3 样品采集与生长性能测定

试验期间，以圈为单位记录采食量。试验结束时空腹称重，记录猪只末重，计算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）、料重比（F/G）。

试验结束当天上午8：00，以圈为单位采集猪新鲜排泄的粪便，使用无菌勺掰开粪便，取未沾到地面的中心部分，放到无菌封口袋中，收集半袋后混匀，一部分分装于EP管中，-80℃保存，用于粪便菌落多样性检测和分析；另一部分分装于50mL离心管，放置于冰盒中，运回实验室后立即处理样品，测定吲哚、3-甲基吲哚、对甲酚以及挥发性脂肪酸（VFA）含量。

1.4 粪便臭味物质测定

饲料常规养分测定参照《饲料分析及饲料质量检测技术》。发酵饲料pH的检测：称取10g样品置于90mL水中，混匀后在摇床上震荡30min，静置，用pH计测定pH。饲料中乳酸含量测定采用对羟基联苯比色法进行测定；乳酸菌含量按照《GB 4789.35-2010食品微生物学检验乳酸菌检验》进行测定。粪便中苯环类化合物（对甲酚、吲哚、3-甲基吲哚）以及VFA的测定采用气相色谱法。

1.5 粪便菌群丰度和多样性测定

粪便总ＤＮＡ的抽提采用PowerFecal® DNA提取试剂盒（MoBio，USA），参照说明书的提取方法提取总DNA。DNA片段的完整性经1％琼脂糖胶检测。随后对16s rRNA V3-V4基因片段进行PCR（ABI GeneAmp®9700型）扩增，所用引物为338F（ 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）。试验采用TransGen AP221-02：TransStart FastPfu DNA Polymerase 20μL反应体系：5× FastPfu Buffer 4μL，2.5ｍｍol·L^-1dNTPs 2μL，Forward Primer（５μｍol·L^-1）0.8μL，Reverse Primer （5μmol·L^-1）0.8μL，FastPfu Polymerase 0.4μL，Template DNA 10ng，补ddH₂O至20μL。PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收，进行MiSeq高通量测序（Illumina，San Diego，USA），高通量测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

对测序得到的序列质量进行质控和过滤后，在97％的相似水平下进行OUT聚类和生物信息统计分析，以MOTHUR软件及序列聚类软件Usearch（vssion 7.1）进行序列比较及分析（对比数据库为Silva）。

1.6 数据处理及统计分析

试验数据以“平均值±标准误”表示。采用SPSS 19.0对发酵饲料营养物质变化进行独立样本t－检验，对猪只生长性能、臭味物质进行单因素方差分析，以Ｐ＜0.05作为差异显著性判断标准。

2.1 饲粮发酵前后营养物质变化

由表2可以看出，基础日粮经发酵处理后，粗蛋白、粗灰分、粗纤维含量未见显著变化，粗脂肪含量显著升高（P＜0.01），钙（P＜0.01）和总磷（P＜0.05）含量显著降低，pH显著降低（P＜0.01），乳酸菌含量为9.67lg cfu·g^-1，乳酸含量为421.67mmol·kg^-1，大肠杆菌未检出。由表3可以看出，基础日粮经发酵处理后，总氨基酸和必需氨基酸含量都没有出现显著变化，非必需氨基酸的丝氨酸（P＜0.05）和精氨酸（P＜0.01）显著降低，丙氨酸显著升高（P＝0.01）。

试验采用短乳杆菌和地衣芽孢杆菌作为发酵菌株，对全价饲料进行了3d自然发酵后，得到发酵全价饲料，经测定发酵饲料的pH为4.11，乳酸菌活菌数为9.67 lg cfu·g^-1，乳酸含量约为421.67 mmol·kg^-1，这与Brooks和Missotten等描述的理想发酵饲料的条件相符。研究表明，发酵饲料的低pH 以及高浓度的乳酸含量可以有效抑制肠杆菌、沙门氏菌等病原菌在饲料中生长繁殖。饲料在发酵过程中，大肠杆菌和沙门氏菌能够使赖氨酸等合成氨基酸降解，生成1，5-二氨基戊烷（尸胺），人工接种乳酸菌，通过控制发酵饲料的乳酸含量和pH，可以有效保护赖氨酸等合成氨基酸不被分解，有利于发酵饲料长期安全存储。本研究测得的发酵全价饲料中既没有大肠杆菌检出，赖氨酸含量也没有显著改变，保证了发酵全价饲料的安全性。

在生长猪生产性能方面，与无抗基础日粮相比，饲喂发酵饲料可以提高生长猪ADFI、ADG和饲料转化率，降低生长猪死淘率。与含抗生素的基础日粮相比，饲喂发酵饲料可以显著提高生长猪ADFI、ADG和饲料转化效率，但差异不显著。大量研究结果表明，饲喂发酵饲料可以减少生长猪饮水量，提高干物质采食量、动物日增重和饲料转化效率。本试验对生长猪生产性能的分析结果与上述研究相一致。表明发酵全价饲料具有替代抗生素、促进动物生长、提高饲料转化率的作用。

研究表明，猪粪便中最主要的恶臭气体是挥发性脂肪酸、酚类、吲哚类、硫醇类。其中对甲酚、吲哚、粪臭素在猪粪臭味物质中的相对含量高且不易去除；挥发性脂肪酸则与猪粪恶臭强度之间存在良好的相关性，且碳链越长除臭难度越大。因此，本试验主要以对甲酚、吲哚、粪臭素和挥发性脂肪酸的含量作为考核指标。从结果中可以看出，饲喂发酵全价饲料可以降低粪便中吲哚、粪臭素、挥发性脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸、戊酸）含量，其中对吲哚、丙酸、丁酸的降低效果达到了显著水平。表明全价料经发酵后，一方面养分消化率得到了提高；另一方面，饲喂发酵饲料改变了猪肠道微生物的菌群结构，从而影响了其对营养物质的消化吸收以及后肠微生物发酵方式，最终影响到粪便挥发性臭味物质的含量。

研究表明，日粮类型可以改变肠道菌群结构，而新鲜粪便菌落组成在一定程度上可以反映猪后肠道菌群组成的特征。本试验比较了无抗基础日粮、含抗生素的基础日粮以及发酵全价料对猪粪便微生物群落的影响。结果表明，与无抗基础日粮相比，含抗生素的基础日粮在一定程度上提高了粪便菌群的丰度，对粪便菌群多样性没有显著影响；与这两组相比，发酵全价饲料显著提高了粪便菌群的物种丰度，在一定程度上提高了物种多样性。此外，饲喂无抗基础日粮、含抗生素基础日粮的猪只粪便物种组成相似，但明显区别于发酵全价饲料组，其中饲喂发酵全价饲料的粪便中属Lactobacillus、Streptococcus、Rikenellaceae、Megasphaera、Oscillospira、Mitsuokella、Prevotella的相对丰度低于其它两组；门Tenericutes，属Clostridium、Turicibacter、Mollicutes、Anaerostipes、Acetitomaculum的相对丰度高于其它两组。发酵饲料可以改变动物胃肠道菌群组成，其中影响最显著的就是乳酸菌，研究表明，饲喂液态发酵饲料可以提高生长猪后肠段中乳酸菌的相对丰度，提高母猪及其后代生长猪粪便中的乳酸杆菌数量，然而本研究发现，饲喂发酵饲料降低了猪只粪便中乳酸菌的相对丰度，这可能是由于发酵饲料对胃肠道中乳酸菌的影响，与不同品种猪的生理阶段、肠道位点以及肠道内容物的培养条件都有关系，因此有待于进一步分析不同肠段位点中菌落组成特征。