复合菌生物饲料包含几个微生物群：酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌以及双岐杆菌等。这种微生物群在生命活动中产生的多种酶，如淀粉酶、胃蛋白酶等，将饲料中的淀粉、蛋白质等大分子有机物质降解为小分子的单糖、双糖、各种氨基酸及其他营养物质，使畜禽更易于吸收。

植物乳杆菌是一种常见于面包、肉类及许多蔬菜发酵制品中的乳酸菌，能通过胃并定植于肠道发挥有益作用。它对肠道微生物有重要影响，在食品发酵和工业乳酸发酵领域有着广泛的应用。酵母是一类结构简单的真菌类微生物，广泛应用于食品和饲料工业。一些科学研究发现，酵母菌或其提取的甘露糖蛋白具有显著非特异性免疫调节和营养功能。腐植酸钠作为一种新型的饲料添加剂广泛应用于饲料工业。本试验以玉米皮、棉籽粕、玉米粉、麸皮、稻壳和糖蜜为原料配制培养基，以植物乳杆菌与酵母菌为发酵菌种，通过探索发酵产物中的活菌数来研究复合菌生物饲料发酵的最适条件。

１.１　材料

１.１.１　菌种

植物乳杆菌（Lactobacillus　plantarum），由北京和美科盛生物技术有限公司保存并提供。酵母菌由内蒙古斯隆生物技术有限责任公司保存与提供。

１.１.２　原料

玉米皮、棉籽粕、玉米粉、麸皮、稻壳和糖蜜由内蒙古斯隆生物技术有限责任公司提供。腐植酸钠由内蒙古永业生物技术有限责任公司提供。

１.１.３　培养基

ＭＲＳ液体培养基（１Ｌ）：蛋白胨１０ｇ，牛肉膏５ｇ，酵母粉４ｇ，葡萄糖２０ｇ，吐温－８０１ｇ，磷酸氢二钾２ｇ，柠檬酸氢二氨２ｇ，乙酸钠５ｇ，硫酸镁０．２ｇ，硫酸锰０．０５ｇ，蒸馏水１０００ｍｌ。植物乳杆菌斜面培养基（１Ｌ）：在ＭＲＳ液体培养基的基础上加２％琼脂粉，在温度１２１℃条件下灭菌１５ｍｉｎ。酵母菌培养基：麦芽汁培养基和麦芽汁琼脂培养基购自广东环凯微生物科技有限公司。原料发酵培养基（１ｋｇ）：玉米皮３５０ｇ，棉籽粕８０ｇ，玉米粉１００ｇ，麸皮１７０ｇ，稻壳２００ｇ，糖蜜１００ｇ。

１.１.４　仪器

恒温培养箱、恒温振荡器、超净工作台、分析天平（感量０.０００１ｇ）、粉碎机和蒸汽灭菌锅等。

１.２　方法

１.２.１　菌种的活化及种子液的制备

植物乳杆菌：将冷冻保存的菌种接种于ＭＲＳ斜面培养基中，３７℃静置培养４８ｈ；待形成菌落后挑取单个菌落接种于ＭＲＳ液体培养基中，在温度３７℃条件下培养２４ｈ，即得种子液。

酵母菌：将冷冻保存的菌种接种于麦芽汁琼脂斜面培养基中，３２℃静置培养４８ｈ，待形成菌落后挑取单个菌落接种于麦芽汁液体培养基中，在温度３２℃条件下振荡培养２４ｈ，即得种子液。

１.２.２　实验设计

１.２.２.１　菌种比例的优化

在基础培养基不变的条件下，设置植物乳杆菌和酵母菌不同的菌种比例，分别为１︰９、３︰７、１︰１、７︰３和９︰１，其他发酵条件一致，最后装入规格为２５０ｍｌ的锥形瓶中进行固态发酵，发酵３６ｈ后通过测定发酵产物中的活菌数来确定最佳菌种比例。

１.２.２.２　装料量的优化

在基础培养基不变的条件下，设置不同的装料量，分别为３０、４０、５０、６０和７０ｇ，其他发酵条件一致，最后装入规格为２５０ｍｌ的锥形瓶中进行固态发酵，发酵３６ｈ后测定发酵产物中活菌数，以确定最佳装料量。

１.２.２.３　发酵底物含水量的优化

在基础培养基不变的条件下，设置发酵底物不同的含水量，分别为４０％、４５％、５０％、５５％和６０％，其他发酵条件一致，最后装入规格为２５０ｍｌ的锥形瓶中进行固态发酵，发酵３６ｈ后通过测定发酵产物中的活菌数来确定发酵底物的最佳含水量。

１.２.２.４　发酵温度的优化

在基础培养基不变的条件下，设置不同的发酵温度，分别为２６、３０、３４、３８和４２℃，其他发酵条件一致，最后装入规格为２５０ｍｌ的锥形瓶中进行固态发酵，发酵３６ｈ后通过测定发酵产物中的活菌数来确定发酵的最佳温度。

１.２.２.５　发酵菌种接种量的优化

在基础培养基不变的条件下，设置不同的菌种接种量，分别为６％、８％、１０％、１２％和１４％，其他发酵条件一致，最后装入规格为２５０ｍｌ的锥形瓶中进行固态发酵，发酵３６ｈ后通过测定发酵产物中的活菌数来确定菌种的最佳接种量。

１.２.２.６　腐植酸钠添加量的优化

在基础培养基不变的条件下，设置腐植酸钠不同的添加量，分别为２％、４％、６％、８％和１０％，其他发酵条件一致，最后装入规格为２５０ｍｌ的锥形瓶中进行固态发酵，发酵３６ｈ后通过测定发酵产物中的活菌数来确定发酵底物的最佳腐植酸钠添加量。

１.２.３　分析方法

活菌数的测定：称取５ｇ发酵产物溶于４５ｍｌ灭菌的生理盐水中，振荡混匀，静置，吸取上清液分别进行乳酸菌和酵母菌活菌数的测定，采用平皿稀释涂布计数法。

２.１　菌种比例的优化

植物乳杆菌和酵母菌分别以不同的接种比例发酵生物饲料，其产物中活菌数的结果见图１。

从图１ 可以看出，植物乳杆菌和酵母菌以１︰１的比例混合发酵时，产物中两种菌的活菌数最高，酵母菌为10×10⁸ ｃｆｕ／ｇ，植物乳杆菌的活菌数为１７.４×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ。植物乳杆菌与酵母菌复合发

酵，酵母菌为兼性厌氧菌，植物乳杆菌为厌氧菌，发酵刚开始时酵母菌利用发酵底物中的氧气快速生长；当氧气消耗完后植物乳杆菌大量繁殖，产生的大量乳酸使发酵底物中的ｐＨ 值下降，酵母菌的生长受到限制。所以，这两种菌同时发酵后产物中的植物乳杆菌的活菌数比酵母菌的高。

２.２　装料量的优化

不同装料量对发酵产物中两种菌的活菌数的影响见图２。

由图２可以看出，在２５０ｍｌ的锥形瓶中，装料量为５０ｇ时，产物中植物乳杆菌的活菌数最高，达１５.８×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ。装料量为４０ｇ时，酵母菌的活菌数最高，达９×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ；但植物乳杆菌的活菌数是所有组中最低的。在５０、４０ｇ装料量条件下产物中酵母菌的活菌数分别为７.２×１０⁸ 和９×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ。

综合两种菌的生长情况，得出最优装料量为５０ｇ。装料量直接影响了发酵底物的厚度。底物厚度小，菌体与空气充分接触，适合酵母菌的生长；底物厚度大，底部的菌体很难与空气接触，氧气少，适合植物乳杆菌生长。

２.３　发酵底物水分含量的优化

微生物在发酵过程中需要有适宜的水分。发酵底物环境中的水分直接影响微生物的生长情况。发酵底物中不同的水分含量对发酵产物中活菌数的影响见图３。

从图３可以看出，发酵底物水分为５０％时，发酵产物中植物乳杆菌的活菌数最高，达１７.３×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ。发酵底物中水分为４５％和５０％时，酵母菌的活菌数分别为１４.３ × １０⁸ 、１４×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ，与其他各组相比均达到较高水平。综合两种菌的生长情况，得出发酵底物中的水分为５０％时最优。

２.４　发酵温度的优化

发酵温度对发酵产物中活菌数的影响见图４。

从图４可以看出，发酵温度为３４、３８和４２℃时，植物乳杆菌的活菌数较高，但酵母菌的生长受到抑制；相反，在较低温度２６℃时酵母菌的生长优于植物乳杆菌。综合考虑两种菌生长的情况，在３４℃时植物乳杆菌数量最高，达到１８.２×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ，酵母菌也达到最高水平１１.４×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ。因此，选择３４℃为最佳发酵温度。温度是影响微生物生长和存活的关键因素，微生物在最适的温度条件下才能生长得最好。温度过高会使微生物菌体中的蛋白质变性或受到不同程度的破坏，降低微生物的繁殖速度；温度过低又抑制了酶的活性，蛋白质的合成速度受到限制，也影响微生物的生长繁殖。

２.５　发酵菌种接种量的优化

植物乳杆菌和酵母菌的接种量对发酵产物中活菌数的影响见图５。

从图５中可以看出，接种量为１０％ 时，发酵产物中植物乳杆菌和酵母菌的活菌数都达到最高，分别为１７.１×１０⁸ 和１４.０×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ 。接种量为１４％组和１０％组的植物乳杆菌数活菌数相差不大，但酵母菌数１４％组明显低于其他各组。因此，综合考虑两种菌的生长情况，且为了降低生产成本，选择最优接种量为１０％。

２.６　腐植酸钠添加量的优化

腐植酸钠不同添加量对发酵产物中活菌数的影响见图６。

从图６可以看出，腐植酸钠添加量为２％ 时，发酵产物中的植物乳杆菌和酵母菌的活菌数含量最高，分别为１７.５９×１０⁸ 和８.８４×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ，均高于腐植酸钠０％组。添加４％、６％和８％的腐植酸钠组，发酵产物中两种菌的活菌数均低于０％组。说明腐植酸钠含量过高可能抑制了这两种菌的生长。

由此可见，腐植酸钠的添加量对微生物的生长影响很大，本试验腐植酸钠最适合的添加量为２％。腐植酸钠对细菌、酵母菌及放线菌有刺激生长、促进繁殖、加速新陈代谢的作用。腐植酸作为增效剂在酿酒工业上能促进酵母细胞的繁殖，提高酒母的生产能力，说明添加一定量的腐植酸钠可以促进微生物的生长。

（１）玉米皮、棉籽粕、玉米粉、麸皮、稻壳和糖蜜等发酵原料确定后，菌种的比例、装料量、发酵底物水分含量、发酵温度、接种量和腐植酸钠添加量等发酵条件的优化是提高产物中益生菌数的重要因素。

（２）本试验得出复合菌生物饲料的最佳发酵工艺条件为：植物乳杆菌和酵母菌的接种比例为１︰１，装料量５０ｇ，发酵底物含水量５０％，发酵温度３４℃，接种量１０％，腐植酸钠添加量２％。在此条件下的复合菌生物饲料中含有植物乳杆菌１７.５９×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ，酵母菌８.８４×１０⁸ ｃｆ／ｇ。